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1、1成骨细胞株 MG63细胞分化过程中线粒体生成的变化作者：王海彬,曾展鹏, 谭彤燕,梁笃,杨冰, 刘锋【摘要 】 【目的】研究成骨细胞分化过程中线粒体生成的变化。 【方法】采用 Mitotracker Green 染色、流式细胞仪检测成骨细胞 MG63 分化过程中线粒体生成的变化；以细胞核基因组为内参, 实时定量 PCR 检测细胞线粒体基因组数量和进一步检测细胞线粒体生成相关基因雌激素相关受体(ERRs) 及其共激活因子过氧化物酶体增殖物激活受体 共激活因子(PGC1s) 表达的变化。 【结果】成骨细胞分化过程中线粒体生成显著减少,线粒体基因组数量显著下降, 细胞线粒体生成相关基因 ERRs
2、及其共激活因子 PGC1s 表达显著降低。 【结论】成骨细胞 MG63 分化过程中线粒体生成显著降低。【关键词】 成骨细胞；分化；线粒体生成；雌激素相关受体Abstract：ObjectiveTo explore the mitochondrial biogenesis in osteoblast differentiation. MethodsMitochondrial biogenesis in osteoblast differentiation was detected by Mitotracker Green staining 2and flow cytometric analysi
3、s. With nuclear genome as the internal standard, real time quantitative polymerase chain reaction (PCR) was applied to detect the number of mitochondrial genome. The expression of estrogenrelated receptors (ERRs) and their coactivators peroxisome proliferatoractivated receptorgamma coactivator1s (PG
4、C1s) which play key roles in mitochondrial biogenesis was detected by real time quantitative PCR. ResultsBoth mitochondrial biogenesis and the number of mitochondrial genome decreased during osteoblast differentiation, and the results of real time quantitative PCR also showed that the expression of
5、ERRs and PGC1s was downregulated. ConclusionMitochondrial biogenesis in osteoblastlike MG63 differentiation is downregulated.Key words：OSTEOBLAST；DIFFERENTIATION；MITOCHONDRIAL BIOGENESIS；线粒体为细胞的生命活动提供场所,是细胞内氧化磷酸化和形成 ATP 的主要场所, 有“细胞能量工厂”之称。线粒体功能和数量的变化被认为在细胞的增殖分化中起着重要作用。线粒体膜电位的变3化和线粒体活性氧的产生直接影响到细胞的生存,
6、因此线粒体被认为在细胞的增殖凋亡中起着关键作用1-2 。除此之外,线粒体的数量和生成也被研究证实在细胞增殖分化中起着重要作用3-5 。成骨细胞的长期培养被广泛用于成骨细胞的分化研究中6-9,但其分化过程中线粒体生成的变化尚无明确报道。本研究采用流式细胞仪检测和实时定量 PCR 检测方法,观察在分化过程中成骨细胞株MG63 细胞线粒体生成相关基因雌激素相关受体（ERRs）及其过氧化物酶体增殖物激活受体 共激活因子(PGC1s) 表达的变化, 现报道如下。1 材料与方法1.1 主要试剂及仪器成骨细胞株 MG63 购自美国典型培养物保藏中心,PT200 型定量 PCR 仪为美国 MJ Researc
7、h 公司产品，FACS Calibur 流式细胞仪为美国 BD Biosciences 公司产品，二氧化碳培养箱购自德国 Heraeus 公司。 DMEM 培养液、胎牛血清、青链霉素、2.5 g/L 胰蛋白酶乙二胺四乙酸二钠(TrypsinEDTA)均购自 Hyclone 公司,Trizol、逆转录试剂盒和 Mitotracker Green染料均购自 Invitrogen 公司,定量 PCR 试剂盒购自大连宝生物公司 ,基因组提取试剂盒购自 Promega 公司, 其他各种化学试剂均为Sigma 公司产品或国产化学分析纯。41.2 细胞培养成骨细胞株 MG63 培养于含体积分数 10%胎牛血
8、清及抗生素(100 U/mL 青霉素、100 g/mL 链霉素)的 DMEM培养液中,在 37、体积分数 5%的 CO2 培养箱湿润培养。将成骨细胞培养至融合状态设定为分化的第 0 天, 之后继续培养 3、7、14 d 用于检测细胞线粒体生成和基因表达的变化。1.3 流式细胞仪检测细胞线粒体生成将分化 0、3、7、14 d的成骨细胞 MG63 使用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 1 次,加入含有10 g/mL Mitotracker Green 染料的无血清温浴培养基,37 温育20 min,PBS 洗涤 2 遍后,收集细胞约 1106 个,PBS 洗涤 2 遍,流式细胞仪检测,每个样本检测 12
9、 000 个细胞,测定细胞的荧光强度值。以第 0 天为对照,设定其线粒体生成为 100%,结果与第 0 天比较。1.4 实时定量 PCR 检测线粒体基因组数量将分化0、3 、7 、 14 d 的成骨细胞 MG63,采用基因组提取试剂盒提取细胞总 DNA。以基因组 DNA actin 为内参,以线粒体DNA(mtDNA)及线粒体基因环氧化酶2(COX2) 为靶标设计引物10, 采用 SYBR Premix Ex Taq 试剂盒进行定量 PCR 检测线粒体基因组的变化。以第 0 天为对照,设定其线粒体基因数量为 1,结果与第 0 天比较。引物序列为： COX2 F：5CATTATTCCTAGAAC
10、CAGGCGAC3 ；COX2 R:5GAATTAATTCTAGGACGATGGGC3 ；mtDNA F:55CAAACCTACGCCAAAATCCA3 ；mtDNA R:5GAAATGAATGAGCCTACAGA3 ；actin F:5CTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC3 ；actin R:5TCCTGCTTGCTGATCCACATC3 。1.5 实时定量 PCR 检测 ERRs 和 PGC1s 的表达将分化0、3 、7 、 14 d 的成骨细胞 MG63,使用 Trizol,并根据其提供的实验步骤提取总 RNA。再使用 Super Script III 反转酶试剂盒反转 2 g
11、总 RNA。以 18S rRNA 为内参,采用 SYBR Premix Ex Taq 试剂盒进行定量 PCR 检测 ERRs 和 PGC1s 的基因表达。基因表达结果以第 0 天为对照,根据定量 PCR 计算公式 2Ct 进行计算。引物序列为：18S rRNA F:5GGTGAAATTCTTGGACCGGC3 ；18S rRNA R:5GACTTTGGTTTCCCGGAAGC3 ；PGC1 F:5TCAGTCCTCACTGGTGGACA3 ； PGC1 R:5TGCTTCGTCGTCAAAAACAG3 ；PGC1 F:5GCTCTCCTCCTTCTTCCTCA3 ；PGC1 R:5ATAGAG
12、CGTCTCCACCATCC3 。1.6 统计学方法实验结果采用 SPSS 5.0 统计软件进行分析。以平均值标准差(s)表示,结果采用卡方检验。2 结果62.1 成骨细胞株 MG63 细胞分化过程中线粒体生成的变化Mitotracker Green 是当今最常用的检测细胞线粒体生成的染料。本研究采用 Mitotracker Green 染料染色和流式细胞仪检测技术检测成骨细胞 MG63 分化过程中线粒体生成的变化。图 1 结果显示：在 MG63 细胞分化过程中, 线粒体生成显著减少。2.2 成骨细胞株 MG63 细胞分化过程中线粒体数量的变化既然成骨细胞 MG63 分化过程中线粒体生成显著减
13、少,本研究进一步采用定量 PCR 法检测成骨细胞分化过程中线粒体基因组数量的变化。图 2 结果显示：在 MG63 细胞分化过程中线粒体基因组的数量显著下降。2.3 成骨细胞株 MG63 细胞分化过程中线粒体生成相关基因表达的变化既然成骨细胞分化过程中线粒体生成及其数量显著降低, 本研究采用定量 PCR 检测 ERRs 及其 PGC1s 的表达。图 3 结果显示：ERRs 和 PGC1s 的表达在成骨细胞 MG63 分化过程中显著降低,表明它们可能参与了成骨细胞分化过程中线粒体生成的调节。3 讨论线粒体在细胞的能量代谢、信号转导、增殖、分化和凋亡中都起着关键作用11 。雌激素相关受体(ERRs)
14、属于核受体超家族,7包括 ERR、ERR 和 ERR。ERR 协同其共激活因子过氧化物酶体增殖物激活受体 共激活因子 1 和 1(PGC1 和 PGC1)在细胞线粒体能量代谢和线粒体生成中具有重要的作用12-13 。ERR 参与和骨骼形成相关的雌激素受体(estrogen receptor,ER)信号途径。和 ER 类似,ERR 能够调节骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达,在成骨细胞分化阶段被合成, 并且能够在大鼠颅顶细胞中控制骨形成,在成骨细胞中过量表达 ERR 可以提高成骨细胞的分化和骨的形成,而用反义方法降低 ERR 的合成可使大鼠的颅顶细胞的增殖明显受到抑制,从而抑制骨结
15、节的形成14 。但有关成骨细胞分化过程中线粒体生成及其雌激素相关受体表达的变化尚无研究。研究采用 Mitotracker Green 染色和流式细胞仪检测发现,成骨细胞 MG63 分化过程中, 细胞线粒体的生成显著降低。进一步采用定量 PCR 检测发现细胞线粒体基因组数量也显著降低,证实细胞线粒体生成的降低至少部分因为基因组的复制降低所致。ERRa 和ERRg 及其共激活因子 PGC1s 在细胞线粒体的生成中起着关键作用15, 进一步采用定量 PCR 检测发现,这些基因的表达均显著降低, 表明 ERRs 和 PGC1s 参与了成骨细胞分化过程中线粒体生成的变化, 并进一步影响成骨细胞分化。综上
16、所述，本研究初步阐明成骨细胞分化过程中线粒体生成的变化,为研究线粒体在成骨细胞分化过程中的作用提供了理论依据。8【参考文献】1De Berardis B, Civitelli G, Condello M, et al. Exposure to ZnO nanoparticles induces oxidative stress and cytotoxicity in human colon carcinoma cellsJ. Toxicol Appl Pharmacol,2010,246（3）：116.2Handschin C,Rhee J, Lin J D, et al. An autoregulator
