《成纤维细胞生长因子受体3在脂多糖抑制成骨细胞分化中作用的初步研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《成纤维细胞生长因子受体3在脂多糖抑制成骨细胞分化中作用的初步研究（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1成纤维细胞生长因子受体 3 在脂多糖抑制成骨细胞分化中作用的初步研究作者：杨京，赵子瑜，何启芬，陈林【摘要 】 目的 本实验拟通过研究激活成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)信号通路时骨组织成骨细胞分化程度在内毒素血症中的变化，为进一步阐明骨组织在炎症反应中变化的机制奠定基础。方法 8 周龄雄性 C57 小鼠和 FGFR3 功能持续增强的软骨发育不全 (Ach)小鼠各 6 只，分为脂多糖 (LPS)组和生理盐水对照组，每组 3 只。LPS 15mg/kg 或等量生理盐水腹腔注射 4 小时后取右侧胫骨提取RNA，定量聚合酶链式反应(PCR) 检测白细胞介素6(IL6) 、肿瘤坏死因子(TNF
2、) 、骨钙素(OC) 的变化。 LPS、碱性成纤维生长因子(bFGF) 处理前成骨细胞系 MC3T3E1 4 小时后定量 PCR 检测IL6、TNF 、OC 水平，成骨诱导 7 天后检测碱性磷酸酶(ALP)活性。结果 LPS 刺激后，骨组织和 MC3T3E1 的炎症递质基因IL6、TNF 的 RNA 水平显著增加(P0.01)，成骨标志性基因OC 表达下调(P0.05)。且 Ach 小鼠相应基因变化幅度显著高于C57 的变化幅度(P0.05)。MC3T3E1 同时用 LPS 与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 处理组的 IL6、TNF 、OC 水平表达水平位于单独用 LPS 或 bFGF 组
3、之间。成骨诱导 7 天后 LPS 处理组细胞ALP 活性显著低于未处理组(P0.05)，bFGF 处理组显著增高2(P0.01)。结论 LPS 刺激骨组织发生炎症反应、抑制成骨细胞分化。在整体动物水平持续性激活 FGFR3 信号通路加重上述反应，在细胞水平低剂量 bFGF 激活 FGFR3 减轻上述反应。 【关键词】 脂多糖;骨;成骨细胞; 成纤维细胞生长因子受体 3Abstract： Objective This experiment focuses on the differentiation of osteoblasts in the endotoximia while the FGFR
4、3 pathway is activating,so as to understand the change of bone tissue in inflammation.Methods Six male C57 mice and 6 male Ach mice (persistently activating function of FGFR3),8 weeks old,were divided into normal saline(NS) group and lipopolysaccharide(LPS) group,3 mice per group.RNA was extracted f
5、rom the right tibias 4 hours after LPS or physiological saline injection,and then the levels of interleukin 6(IL6),tumor necrosis factor (TNF),osteocalcin (OC) in tibia and osteoblast were measured by quantitative realtime PCR.Four hours after the preosteoblast cell line MC3T3E1 was cultured with LP
6、S and bFGF,the levels of IL6,TNF,OC in tibia and osteoblast also were measured by quantitative realtime PCR.The MC3T3E1 activities of alkaline phosphatase(ALP) were detected 7 days 3after culture.Results Both of the levels of IL6 and TNF in tibias and MC3T3E1 were increased while the levels of OC in
7、 tibias and MC3T3E1 were decreased 4 hours after LPS administration(P0.01).The expression change was more huge in Ach mice(P0.05).The expressions of IL6,IL1 and OC in MC3T3E1 cultured with LPS and bFGF were higher than those cultured only with LPS and lower than those only with bFGF.Compared with th
8、e untreated group,the activity of ALP in MC3T3E1 was decreased in LPS group(P0.05) and increased in bFGF group(P0.01).Conclusion LPS could involve bone tissue in inflammation and inhibit the differentiation of osteoblast.Persistently activating the function of FGFR3 in vivo could aggravate these eff
9、ects.And low dose of bFGF in vitro which activates FGFR3 could relieve these effects.Key words：LPS;bone;osteoblast;FGFR3脂多糖(LPS)是脓毒症中主要致病菌革兰阴性菌的主要致病成分。LPS 可引起多种脏器损伤、功能紊乱甚至衰竭。但骨骼在 LPS引起的内毒素血症中的变化和发生机制尚未完全阐明。我们在前期的研究中利用全基因组基因芯片扫描发现，LPS 注射 4 小时后小鼠4骨组织中成纤维生长因子受体 3(FGFR3)表达显著下调。有研究发现成年期 FGFR3 敲除小鼠骨质减少，并且
10、体外培养的骨髓间充质细胞向成骨分化增强1。这提示 FGFR3 可负性调节成骨细胞的分化。但有文章发现在细胞培养实验中 LPS 抑制成骨细胞的分化 2。那么LPS 引起的 FGFR3 表达下降是否为机体的代偿反应?本实验将通过在动物、细胞水平增强 FGFR3 信号通路后检测 LPS 刺激下成骨细胞分化的变化，以初步明确 FGFR3 信号通路在骨组织对 LPS 反应中的作用，为进一步阐明骨组织在炎症反应中的变化奠定基础。材料与方法1 动物分组8 周龄雄性 C57 小鼠和 Ach 小鼠各 6 只，分为 LPS 组和生理盐水(NS)对照组，每组 3 只。LPS 15mg/kg (Sigma)或等量生理
11、盐水腹腔注射 4 小时后取右侧全长胫骨，剔除肌肉、软组织后液氮保存备用。2 细胞培养前成骨细胞系 MC3T3E1(购自北京协和细胞库)以含10%FBS(GIBCO)的 MEM(GIBCO)培养至融合后，以 LPS 5100ng/ml(sigma)、10ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(BD)、LPS100ng/ml+bFGF 10ng/ml 分别处理细胞 4 小时后搜集细胞备用。另取融合细胞用成骨诱导液培养：含 50g/ml 维生素 C (sigma)、10mmol/L 磷酸甘油钠(sigma)、100nmol/L 地塞米松(sigma) 的完全培养基。以 100ng/ml LP
12、S、bFGF10ng/ml 、LPS100ng+bFGF10ng/ml 分别处理 7 天后搜集细胞备用。每组实验重复 2 次，相同培养条件下以不加任何处理因素的细胞作为空白对照。3 定量聚合酶链式反应(PCR)将相应时间点所取的上述胫骨组织和培养细胞以 Trizol 法提取总 RNA。紫外分光光度仪测取 RNA 浓度，取 1g 总 RNA 为模板, 参照逆转录试剂盒(Exscript,TAKARA) 的说明书进行逆转录反应。cyclophilin A、白细胞介素6(IL6) 、肿瘤坏死因子 (TNF)、骨钙素(OC)引物由上海生工生物工程公司合成(表 1)。PCR 反应体系配制及扩增条件设置参
13、照定量 PCR 反应试剂盒说明书进行(SYBR Primer Ex Taq kit,TAKARA)。最后，由定量 PCR 仪(Mx3000P)自动给出 c(t)值和目的基因的相对含量。4 碱性磷酸酶(ALP) 活性检测6参照 ALP 活性检测试剂盒(sigma)进行。成骨诱导 7 天细胞以裂解液：10mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸(TrisHCl) ，2mM 氯化镁，0.05% Triton X100(pH8.2)裂解后吸取 30l 上清加入至300l ALP 活性测定液中，颠倒混匀后在 37反应 30 分钟，加入1ml 0.1N 的 NaOH 中止反应，测定 405nm 的吸光值，以 0.4N的
14、 HCl 作对照。同时吸取 30l 上清加入至 70l 生理盐水中，然后加入 1ml BCA 工作液，混匀后 37反应 30 分钟，测定 562nm 的吸光值，以 100l 生理盐水作对照。每个样品取其 OD405/OD562的比值做统计分析。5 统计分析使用 SPSS10.0 统计软件，采用 OneWay ANOVA Tukey法比较组间差异，以 P0.05 为差异显著。表 1 定量 PCR 引物序列结 果1 FGFR3 在 LPS 引起的炎症反应中的作用LPS 刺激后，与生理盐水组比较，胫骨组织和 MC3T3E1 细胞的炎症递质基因 TNF、IL6 的表达水平显著增加(P0.01)7(图
15、1)。且 Ach 小鼠胫骨组织 LPS 处理后 TNF、IL6 的表达水平增幅显著高于 C57 的变化幅度。bFGF 处理 MC3T3E1 细胞 4 小时后其 TNF、IL6 表达水平略有增加，同时用 LPS 与 bFGF 处理后其 IL6、TNF 水平表达水平有所增加，但低于单独用 LPS处理组(图 1)。2 FGFR3 在 LPS 引起的成骨细胞分化抑制中的作用LPS 处理后胫骨组织和 MC3T3E1 细胞的成骨标志性基因OC 表达显著低于生理盐水组(P0.01)。 Ach 小鼠胫骨组织 LPS处理后 OC 表达水平下降幅度显著高于 C57 小鼠的降幅(图 2a)。bFGF 处理 MC3T
16、3E1 细胞 4 小时后其 OC 表达水平显著高于空白对照组(P0.01)，同时用 LPS 与 bFGF 处理后其 OC 水平表达水平增加(P0.01)，但略低于单独用 bFGF 处理组的表达水平(图2b)。成骨诱导 7 天后，与空白对照组的 ALP 活性比较，LPS 处理细胞下降(P0.05)，bFGF 处理组显著增高(P0.01)，同时用LPS 与 bFGF 处理组虽略低于单独用 bFGF 处理组的 ALP 活性但仍显著高于空白对照(P0.01)(图 2c)。讨 论8近年来研究发现骨骼不仅是人体的支撑结构，其更重要的功能是作为一种内分泌免疫器官调节全身内环境的稳定。成骨细胞可通过分泌 OC 调节体内血糖水平3。炎症反应时成骨细胞在多种炎症因子的刺激下会产生各种细胞因子，如高迁移率组蛋白B1(HMGB1)、IL6 、激活核因子 NF-B 受体的
