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1、1成神经分化的骨髓间充质干细胞向 C6 细胞条件培养基和 SDF1 的趋化性迁移研究作者：包普花, 王敏, 苏军, 刘孟宇, 张焕相【摘要 】 目的: 探讨成神经分化的骨髓间充质干细胞(BMSCs) 向C6 细胞条件培养基和 SDF1 的趋化性迁移。方法 : 采用碱性成纤维生长因子(bFGF) 、 丁羟基茴香醚(BHA)、 二甲基亚砜(DMSO)联合诱导剂对 BMSCs 进行诱导分化, 通过免疫荧光染色检测诱导的细胞表达神经前体细胞标志物 Nestin、 IIITubulin 和 NSE 的情况。运用 Dunn chamber 研究成神经分化的 BMSCs 向胶质瘤和SDF1 的迁移。结果:
2、BMSCs 能诱导分化成神经元样细胞, 而对照组的 BMSCs 形态无变化。Dunn chamber 分析显示, C6 细胞条件培养基组和 SDF1 组诱导细胞的迁移速率和迁移效率明显高于对照组, 表明 C6 细胞条件培养基和 SDF1 对 BMSCs 具有趋化作用, 单个细胞迁移轨迹实验也证实了这一结果。此外, 分化不同状态的 BMSCs 向 C6 细胞条件培养基和 SDF1 的趋化程度也不同。结论: BMSCs 的定向迁移与分化状态密切相关。 【关键词】 骨髓间充质干细胞; 分化; 迁移; 趋化性Abstract AIM: To investigate the tropism of bon
3、e 2marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in neurogenic differentiation for glioma and SDF1. METHODS: BHA, bFGF, and DMSO were used to induce the neural differentiation of BMSCs, and the expression of neural markers, Nestin, IIITubulin and NSE were analyzed by immunocytochemistry. We investigated, by
4、 using the Dunn chamber, the migration of BMSCs in neurogenic differentiation towards glioma and SDF1. RESULTS: BMSCs could be induced to differentiate into neuronlike cells, while the control remained the morphology of BMSCs. Dunn chamber analysis revealed that both the migration speed and efficien
5、cy of cells induced by C6 conditioned medium and SDF1 were higher than control, demonstrating the chemotactic effect of both C6 conditioned medium and SDF1 on BMSCs. These results were confimed by examination of migration tracks of individual cells. Moreover, BMSCs at different states of differentia
6、tion showed different degree of tropism for C6 conditioned medium and SDF1. CONCLUSION: The directed migration of BMSCs is closely related to the differentiation states of these cells.KeywordsBMSCs; differentiation; migration; tropism3恶性胶质瘤是目前最为盛行的脑瘤, 干细胞移植极有希望治疗胶质瘤。因骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal
7、 stem cells, BMSCs)体内体外均显示很强的胶质瘤趋化性 1, 所以应用BMSCs 治疗胶质瘤即是很好的细胞治疗手段。然而处于不同分化状态的 BMSCs, 尤其是成神经分化过程中的 BMSCs 能否改变其向胶质瘤趋化性迁移的能力, 还不得而知。众多研究表明 , C6 细胞分泌的多种细胞因子影响 BMSCs 的定向迁移, 如 SDF1。鉴于此, 本实验利用化学诱导剂联合细胞因子的诱导方法, 研究成神经分化的BMSCs 向 C6 细胞条件培养基和 SDF1 的趋化性迁移。1 材料和方法1.1 材料 倒置相差显微镜购自日本 Olympus 公司、 CO2培养箱购自德国 Heraeus
8、公司、 恒温离心机购自法国 Jouan 公司、35 mm 培养皿和细胞培养瓶购自美国 Coring costar 公司。LDMEM 培养基、 HDMEM 培养基、 胎牛血清(FBS)均购自Gibco 公司, 小牛血清(FCS)购自 Hyclone 公司, Percoll 淋巴细胞分离液购自 Pharmacia 公司, 胰蛋白酶(Trypsin)、 EDTA、 碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、 丁羟基茴香醚 (butylated hydroxyanisole, BHA)、 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO
9、)、 多聚赖氨酸(PLL)、 FITC 标记 IIITubulin4抗体均购自 Sigma 公司, N2 Supplement 购自 PAA 公司, Hochest 33258、 L谷氨酰胺购自上海生工, FITC 标记抗鼠CD29、 CD34、 CD45、 CD71、 CD90 (mAb)、 PE 标记抗鼠CD106 (mAb)购自 Cedarlane 公司, 抗鼠 Nestin、 NSE、 GFAP (mAb)均购自 Chemicon 公司, FITC 标记抗鼠二抗购自 Upstate 公司, SDF1 购自 Peprptech Inc 公司。SD 大鼠购自苏州大学实验动物中心。1.2 方
10、法1.2.1 BMSCs 的分离培养与鉴定 自 100150 g SD 大鼠的股骨、 胫骨中提取骨髓细胞, 置于密度为 1.073 g/mL 的 Percoll分离液, 3 000 r/min 离心 30 min。去上清, 吸取白膜层, PBS 洗细胞, 1 800 r/min 离心 10 min。用含 100 mL/L FBS 的 LDMEM培养液悬浮细胞, 计数, 将细胞密度调至 2109/L, 接种于 T25 培养瓶中, 置于 CO2 培养箱中, 37、 50 mL/L CO2 饱和湿度条件下培养。每 3 d 换液。待细胞达 90%汇合时用含 2.5 g/L 胰蛋白酶、0.2 g/L E
11、DTA 的消化液按 12 的比例进行消化传代, 用含 100 mL/L CS 的 LDMEM 培养液培养。BMSCs 接种于 35 mm 培养皿中, 培养皿中预先放置包被有0.05 g/L 多聚赖氨酸 (PLL)的盖玻片, 待细胞长至 60%汇合, 进行免5疫荧光染色鉴定其表面抗原 CD29、 CD34、 CD45、 CD71、 CD90、 CD106 的表达。染色步骤如下: 弃培液, 加入 40 g/L 多聚甲醛 4过夜固定细胞。弃去多聚甲醛 , 用 PBS 洗 3 次。加一滴(20 L) mAb 滴在包好封口膜的载玻片上, 把固定了细胞的盖玻片覆盖在抗体上, 于湿盒内室温孵育 90 min
12、。 PBS 洗细胞, Hochest 33258 室温 5 min, PBS 洗细胞, 蒸馏水洗细胞, 500 mL/L 的甘油(PBS 配制)封片。免疫荧光染色的细胞用德国 Leica AF6000 荧光显微镜观察并采集图像。1.2.2 BMSCs 的成神经诱导及鉴定 第 8 代 BMSCs 以2107/L 的密度接种于预先包被盖玻片的 35 mm 培养皿中, 待细胞贴壁后采用以下诱导处理方法。(1)实验组: 换成含 10 g/L bFGF、 100 mL/L CS 的 L DMEM 预诱导液培养, 24 h 后换成含有 200 mol/L BHA、 20 mL/L DMSO 的 LDMEM
13、 诱导液诱导分化。5 h 后换成含有 10 mL/L N2 的 HDMEM 维持培养基分别培养 18 h 和 48 h。(2)对照组: 始终以 BMSCs 常规培养基培养。定期观察细胞, 取诱导前及预诱导 24 h、 诱导后 5 h、 维持 18 h和 48 h 的细胞固定, 进行免疫荧光细胞化学染色检测神经细胞标志物 Nestin、 IIITubulin、 NSE 的表达情况。染色步骤参考前文细胞表型鉴定部分, 对于一抗非直接标记的 , 需要加二抗, 即一抗孵育后, PBS 洗细胞, 采用与一抗同样的方式滴加二抗 , 室温孵育 60 min, PBS 洗细胞后用 500 mL/L 甘油封片,
14、 荧光显微镜下观察摄影。61.2.3 C6 细胞条件培养基的收集 C6 细胞在 75 cm2 培养瓶长到 80%汇合度, 弃培养基, PBS 洗细胞, 加入 10 mL LDMEM, 24 h 后收集这些培养液, 离心除去细胞碎片 , 即为 C6 条件培养基, 置-20保存备用。1.2.4 分化细胞的趋化性迁移 上述方法对 BMSCs 成神经诱导, 取诱导前及预诱导 24 h、 诱导后 5 h、 维持 18 h 和 48 h 的细胞做 Dunn chamber 迁移实验, 方法2如下: chamber 内外槽加满 LDMEM, 将长有细胞的盖玻片盖在槽的正上方, 细胞面朝下, 并使盖玻片一方紧
15、盖住桥, 而不盖住外槽; 工业凡士林封住盖玻片三方, 吸水纸吸出外槽液体, 加入 C6 细胞条件培养基或 SDF1, 凡士林封口; 对照组则不需吸出外槽的 LDMEM, 直接用凡士林封住四面。用德国 Leica AF6000 荧光显微镜 37活细胞拍摄 8 h。1.2.5 统计学分析 实验数据通过 NIH ImageJ 软件处理, 细胞迁移通过德国 Leica AF6000 活细胞工作站进行拍摄。实验中所有的实验数据和统计量化图由 SYSTAT.SigmaPlot 和 SYSTAT. SigmaStat 计算并绘制。数据分析 P0.05 即认为有统计学意义。72 结果2.1 BMSCs 的表型
16、鉴定 用免疫荧光染色的方法检测第 8 代BMSCs 常见的表面抗原。荧光显微镜下可观察到, 在蓝色激发光下, 经 FITC 标记的 CD29、 CD71、 CD90 染色的细胞表面呈绿色荧光; 绿色激发光下 , PE 标记的 CD106 染色呈现红色荧光, 均为阳性(图 1)。造血干细胞特异性抗原 CD34、 CD45 则为阴性(结果未示), 以上结果与文献报道一致3。2.2 BMSCs 成神经诱导过程中的形态观察 我们首先观察了BMSCs 成神经诱导过程中的形态学变化(图 2)。接种 24 h, 细胞成大多角型、 扁平星形 (图 2A)。预诱导 24 h, BMSCs 由其典型形态变成长梭形, 胞体出现收缩, 细胞边缘变得不规整(图 2B)。诱导 5 h时, 胞体均呈圆形或椭圆形, 折光性增强, 伸出细长的突起, 并且多为两极
