《慢病毒载体介导的小鼠骨髓树突状细胞RelB基因沉默》由会员分享，可在线阅读，更多相关《慢病毒载体介导的小鼠骨髓树突状细胞RelB基因沉默（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1慢病毒载体介导的小鼠骨髓树突状细胞 RelB 基因沉默作者：包杰, 王前 郑磊, 裘宇容 曾方银, 杨春莉, 黄宪章【摘要 】 目的: 利用慢病毒载体沉默小鼠骨髓树突状细胞(DC)的 RelB 基因, 建立 RelB 基因低表达的骨髓致耐受 DC, 为自身免疫病的防治提供新方法。方法: 设计小鼠 RelB 基因干扰的靶序列 R5, 合成并克隆到慢病毒载体上, 与慢病毒的包装材料在 293FT 细胞中包装成病毒颗粒, 收集病毒上清, 测定病毒滴度, 然后包装慢病毒感染 DC, RTPCR 和免疫荧光方法检测, 灰度扫描并用软件分析 RelB基因的表达水平, 未成熟 DC 作对照组, 选择 T6
2、 包装病毒为 RNAi的阴性对照。结果: RTPCR 和免疫荧光方法发现 R5 病毒感染的DC RelB 基因表达水平与未成熟 DC 基因表达水平接近, 低于成熟DC 的表达水平（P0.05）, 而实验对照 T6 组病毒感染的 DC 其RelB 基因表达水平高于未成熟 DC（P0.05）和 R5 病毒转染DC 组（P0.05） 。结论: 小鼠骨髓 DC 表达的 RelB 基因被慢病毒载体有效沉默, 有望成为 DC 免疫治疗的新载体。 【关键词】 慢病毒载体; 树突状细胞; RelB 基因; 基因沉默RelB（avian reticuloendotheliosis viral(vrel) onc
3、ogene 2related B）是核转录因子 NFB 家族成员之一, 在树突状细胞(dendritic cells, DC)的基因表达调控中具有重要的作用1 。我们前期的研究发现 RelB 基因的表达水平与 DC 的成熟状态有关, 而DC 的成熟与否决定了免疫反应的方向 2, 3 。因此, DC 在感染免疫、 自身免疫、 移植免疫、 肿瘤免疫等免疫介导的疾病中都起着举足轻重的作用。利用未成熟 DC 具有诱导机体免疫耐受的特性, 构建具有致 T 细胞免疫耐受的致耐受 DC 并应用于自身免疫病的免疫治疗目前已成为临床免疫治疗的一个热点。RelB 基因作为影响DC 发育成熟的关键基因 , 其表达水
4、平的高低决定了 DC 的免疫功能。利用可高效、 特异下调目标基因表达的 RNAi (RNA interference, RNAi) 技术可实现基因表达沉默。然而, RNAi 效应与基因转移效率有密切关系。由于体外培养的骨髓 DC 对多种脂质体介导的基因转移效率均极低, 严格限制了 DC 在临床免疫治疗中的应用以及 DC 疫苗的研制4 。而慢病毒载体 , 具有既可感染分裂细胞又可感染非分裂细胞, 还可整合到宿主细胞的染色体基因组上并具有免疫原性小等优点5, 在基因治疗领域中最具发展前景, 为 DC 的临床免疫治疗带来了希望。为此, 我们利用 RelB 基因的 RNAi 慢病毒载体进行了小鼠骨髓
5、DC 的 RelB 基因沉默, 构建了 RelB 基因低水平表达的致耐受 DC, 为 DC 治疗自身免疫性疾病和预防移植免疫排斥问题作一探讨。1 材料和方法31.1 材料 BLOCKiTTM U6 RNAi Entry Vector 试剂盒、 LipofectamineTM 2000 购自 Invitrogen 公司; RelB 的慢病毒干扰片段利用 Invitrogen 网站上的免费软件设计由上海生工生物工程有限公司合成; 高糖 DMEM 培养基和 RPMI1640 培养基购自 Gibco公司; PE 标记的大鼠抗小鼠 CD86(B72) mAb、 PE 标记的大鼠抗小鼠 IA/IE 单克隆
6、抗体 (mAb）和 PE 标记的大鼠抗小鼠 CD40 mAb 均来自 BD PharMingen 公司; 胎牛血清购自杭州四季青公司 ; 质粒 Midi 抽提试剂盒购自 Qiagen 公司; Polybrene 购自 Sigma公司; C57BL/6 小鼠（7 9 周龄, SPF 级）由南方医科大学动物研究所提供。1.2 方法1.2.1 小鼠 RelB 基因 RNAi 慢病毒载体的构建 按参考文献6方法构建小鼠 RelB 基因 RNAi 慢病毒载体。简言之, 根据网站（https: / RelB 基因（NM_009046）的特异性干扰片段, 序列为R5(RelB) Top strand: 5C
7、ACCGCTGCTCTGTGATGACCAGGTACGAATACCTGGTCATCACAGAGCAG3; Bottom strand: 5AAAACTGCTCTGTGATGACCAGGTATTCGTACCTGGTCATC4ACAGAGCAGC3, GC 含量在 35%55%, 在 GenBank 数据库进行 BLAST 分析其与其他基因的同源性。在干扰片段上游链(Top strand)的 5端加上 CACC 四个碱基, 在下游链(Bottom Strand)的5端加上 AAAA 四个碱基, 环（loop）为 CGAA。选择 T6(mock)做为阴性对照, Top strand: 5CACCGT
8、TCCTTCTGACTAAAGTCCGTCGAAACGGACTTTAGTCAGAAGGAA3;Bottom strand 5AAAATTCCTTCTGACTAAAGTCCGTTTCGACGGACTTTAGTCAGAAGGAAC3。室温下在 20 L 反应体积中 ds oligo 退火, 严格按操作说明书进行 95孵育 4 min 慢慢冷却至室温形成双链寡核苷酸（ds oligo）, 进行 100 倍比稀释终浓度为 5 nmol/L, 取500 nmol/L 的 ds oligo 于 40 g/L 琼脂糖电泳检验退火的 ds oligo 的完整性。在 20 L 反应体系连接 ds oligo 至
9、pENTRTM/U6 载体上 , 转化 TOP10 感受态细胞, 卡那霉素抗性（50 mg/L）平板筛选阳性克隆, U6 前引物测序, 序列为5GGACTATCATATGCTTACCG3, 将阳性克隆与pLenti6/BLOCKiTTMDEST vector 进行重组, 转化 Stb13 感受态细胞, 氨苄青霉素（ Amp）抗性筛选后, 进行 30 mg/L 氯霉素的LB 平板中的药物负筛选, U6 前引物测序验证。1.2.2 慢病毒的包装和滴度测定 用 OptiMEM 培养液稀释ViraPowerTM 包装质粒混合物和重组 RelB 基因慢病毒表达质粒, 5在质脂体 Lipofectamin
10、eTM 2000 的介导下, 感染 293 FT 细胞悬液（共 6106 个细胞）, 轻轻混匀, 在 37 、 5 mL/L CO2 培养箱内培养。次日更换成含丙酮酸钠的完全培养液, 转染 48 h 后, 收获含病毒的上清液, 4, 3 000 r/min 离心 5 min, 分装病毒上清液, -80保存备用。以 2105/孔的密度将细胞接种在 6 孔板中, 次日, 将慢病毒贮液梯度稀释从 10-210-6, 去除细胞的培养液, 将梯度稀释的含病毒培养液分别加入 6 孔板各孔中 , 病毒感染的同时加入工作液浓度为 6 mg/L 的 Polybrene 以增加感染效率, 次日去除含病毒的培养液更
11、换为 2 mL 的完全培养液, 感染后 48 h 加入含杀稻瘟菌素（浓度为 10 mg/L）的培养液, 进行药物筛选 , 筛选 10 d 后, 未感染的细胞全部死亡, 感染的细胞形成肉眼可见的克隆, 在显微镜下计数克隆数（50 个细胞为一个克隆）, 确定病毒的滴度Transducing Unit (TU)/mL。1.2.3 小鼠骨髓 DC 培养鉴定和实验分组 参考文献2, 3方法培养小鼠骨髓 DC。简言之 , 无菌取 C57BL/6 小鼠股骨和胫骨, 去除附着的肌肉和结缔组织, 冲出骨髓细胞, 低渗去除红细胞, 细胞计数, 在 100 mL/L 胎牛血清（杭州四季青公司）的 RPMI1640
12、培养液中添加终浓度均为 10 g/L 的细胞因子 GMCSF 和 IL4, 接种 24 孔细胞培养板, 1 mL/孔, 细胞数 2106/孔, 37、 50 mL/L CO2 孵育, 隔日半量换液, 补充等量的细胞因子。实验分 4 组, (1)未成熟DC 组: 未加任何处理因素的体外培养 6 d 的骨髓 DC, 经流式细胞6术（FCM ）鉴定; (2)成熟 DC 组: 在培养结束前 24 h 添加 1 mg/L的脂多糖 LPS 刺激, 并于第 6 天收集的 DC, 经 FCM 鉴定; （3）病毒 R5 感染的 DC 组: 利用体外培养 4 d 的未成熟 DC 加 20 L 病毒R5 并继续培养
13、 48 h 于第 6 天收集的 DC; （4）病毒 T6 感染的 DC组: 利用体外培养 4 d 的未成熟 DC 加 20 L 病毒 T6 并继续培养48 h 于第 6 天收集的 DC。1.2.4 FCM 检测 DC 分别与 PE 标记的大鼠抗小鼠 CD86 (B72) mAb、 PE 标记的大鼠抗小鼠 IA/IE mAb 和 PE 标记的大鼠抗小鼠 CD40 mAb 按 1 mg 标记的 mAb 与 1105 个 DC 的比例混合后, 于 4 标记 30 min, 1 000 r/min 离心 10 min, 去上清, 用0.01 mol/L 的 pH 为 7.4 的 PBS 缓冲液（含 2
14、0 g/L BSA 和 0.1 g/L NaN3）洗 2 次, 进行 FCM 检测。利用 DC 细胞标记表达水平的高低进行 DC 成熟度的鉴定。1.2.5 DC 中 RelB 基因表达的 RTPCR 检测 自行设计引物检测DC 中 RelB 基因的 mRNA 表达水平, RelB（NM_009046 ）引物序列为 F: 5CCGGCACAGCTTTAACAACCT3; R: 5CGTTTGCTCTCGATTCCATGTG3, 产物大小为 648 bp。用小鼠 actin 基因作内参照, actin（X03765）引物序列为: F: 5TCCCTGTATGCCTCTGGTCGTA3; R: 5A
15、CCGCTCGTTGCCAATAGTGAT3, 产物大小为 343 bp。7采用两步法 RTPCR, 参照 Invitrogen 公司的 TrizolTM kit 的操作说明书抽提 RNA。参照 TaKaRa 公司 AMV 反转录酶说明书反转录。反转录程序为 42 20 min, 99 5 min, 5 5 min。RelB cDNA的 PCR 反应如下: 1 L 的上述反转录产物、 1PCR buffer、 1.5 mmol/L MgCl2、 0.15 mmol/L dNTPs、 上、 下游引物各 0.4 mol/L、 1 单位 Taq DNA 聚合酶, 添加灭菌双蒸水至 25 L。PCR 扩增程序如下: 94 3 min32(94 30 s, 55 45 s, 72 1 min)72 5 min。内参 actin 的 RTPCR 反应体系和反应程序均同 RelB 基因的条件。PCR 产物经 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳后用溴化乙锭（EB）染色检测。并以 UVI 凝胶成像系统摄像, Gel pro 软件分析条带的灰度值, 以 RelB/actin 的比值表示 RelB 的相对表达量。1.2.6 RelB 表达的免疫荧光检测 用吸管将 DC 吹下, 小心地滴到盖玻片上。室温干燥后, 用 40 g/L 多聚甲醛室温固定 30 min, 以双蒸水洗
