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1、1慢病毒载体介导 GFP 标记大鼠骨髓间充质干细胞作者：魏峰，马爱群，王亭忠，张静【摘要 】 目的 探究慢病毒载体介导绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein, GFP)标记大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的理想条件 ,以获得稳定高表达GFP 的 MSCs 亚群。方法 慢病毒载体介导 GFP 以25、50、100、200 和 400 的感染复数(multiplicity of infection, MOI)分别作用 12h 和 24h 感染 MSCs，倒置荧光显微镜及流式细胞术检测各组的感染效率和荧光强度，MTT 法评价
2、感染对 MSCs 增殖的影响，从而确定理想的感染条件。平皿克隆套环法挑选理想条件下感染的 MSCs 单克隆。结果 MOI 为 100、200 和 400 作用24h 时，感染效率较高，分别为 88.94%、 99.65%、99.42%;MOI为 100 和 200 时，感染对 MSCs 增殖无影响，MOI 为 400 时，感染的 MSCs 增殖减慢。挑选 MOI 为 200、作用 24h 感染组的单克隆细胞，其 1 月时感染效率为 99.95%，且荧光均一、强度很强。结论 MOI 为 200 作用 24h 是慢病毒载体介导 GFP 标记 MSCs 的理想条件;通过细胞单克隆技术可获得稳定高表达
3、 GFP 的 MSCs 亚群。 【关键词】 间充质干细胞;慢病毒载体;绿色荧光蛋白;单克隆2ABSTRACT:Objective To determine the optimal condition for labeling rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) with green fluorescent protein (GFP)infection by lentiviral vector so as to establish a subgroup of MSCs which have a high level of GFP expre
4、ssion. Methods MSCs were infected with GFP by lentiviral vector for 12h or 24h at different MOI (25, 50, 100, 200 and 400). The infection efficiency and fluorescence intensity were analyzed by inverted fluorescent microscopy and flow cytometry. The effect of infection at different MOI on proliferati
5、on of MSCs was evaluated by MTT. Based on those mentioned above, we could determine the optimal condition for infection. Then single cell clones of MSCs labeled with GFP under optimal condition were selected by using cloning rings. Results The efficiency of infection for 24h at MOI 100, 200 and 400
6、was 88.94%, 99.65% and 99.42%, respectively. The infection had no significant effect on the proliferation of MSCs infected at MOI 100 or 200, compared with MSCs without infection. However, those MSCs infected at MOI 400 proliferated slowly. The rate of GFP expression on singlecell clone of MSCs infe
7、cted for 24h at MOI 200 was 99.95%, and their 3fluorescence intensity was strong and uniform. Conclusion Infection for 24h at MOI 200 is optimal for labeling rat bone marrow MSCs with GFP by a lentiviral vector. A subgroup of MSCs which have a stably high level of GFP expression can be obtained by s
8、ingle cell cloning technique.KEY WORDS: mesenchymal stem cell; lentiviral vector; green fluorescent protein; monoclone骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一种来源于中胚层具有多向分化潜能的成体干细胞，在一定条件下可分化为软骨细胞1、神经细胞2、胰岛细胞3、肺上皮细胞4 等各胚层的组织细胞。目前已成为再生医学研究中的热点细胞。然而稳定高效标记 MSCs 是进行体内示踪研究亟待解决的关键问题。慢病毒载体介导的转基因具有效率高、外源基因长期稳
9、定表达、安全性好5等优点。因此，我们拟通过慢病毒载体介导绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)来标记大鼠骨髓 MSCs，探讨其标记的理想条件，从而建立稳定高表达 GFP 的 MSCs 亚群，为体内深入研究 MSCs 的分化行为奠定基础。1 材料与方法41.1 材料 低糖 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium)和胎牛血清购自 Gibco 公司;Percolls 细胞分离液(1.131g/mL)购自 Pharmacia 公司; 四甲基偶氮唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)均购自 Sigma 公司; 携带 GFP 的慢病
10、毒载体 pGC FUGFPLV 购自上海吉凯基因化学有限公司。克隆环为 Corning公司生产;酶标仪为美国 BioTek 公司生产;流式细胞仪为美国 BD公司生产。1.2 方法1.2.1 大鼠骨髓 MSCs 的培养及表面标志鉴定 参照文献方法6，主要采用 Percolls 密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓 MSCs，流式细胞术检测 2 代 MSCs 表面CD34、CD45、CD54、CD90 的表达。1.2.2 慢病毒载体介导 GFP 感染 MSCs 将 3 代 MSCs 制成单细胞悬液，连续计数 3 次，取平均值为最终细胞密度。将细胞稀释为 1104 个/mL ，接种于 96 孔
11、板中(2 个时间点，5 个 MOI 梯度，每个梯度 3 个复孔，共 30 个孔)，每孔 200L，培养 16h 后，各孔以 25、50、100、200、400 的 MOI 加入携带 GFP 的慢病毒载体，分别感染 12h 和 24h，PBS 冲洗 5 遍，换为不含病毒载体的完全培养基继续培养，以后每天观察感染结果。51.2.3 流式细胞仪检测 GFP 的感染效率 将 MOI 为100、 200、 400 感染 24h 的 MSCs 制成单细胞悬液，20g/L 的多聚甲醛固定 10min，流式细胞仪测定 GFP 的表达率及平均荧光强度，未感染的 MSCs 作为对照。1.2.4 MTT 法检测感染
12、后的 MSCs 增殖情况 MOI 为100、 200、 400 感染 24h 的 MSCs 和未感染的 MSCs 共 4 组，每组 7 孔，每孔 3 个复孔，每孔接种 1103 个细胞。培养 24h 后，加入浓度为 5mg/mL 的 MTT 20L，培养 4h 后弃去培养液，加入DMSO 200L，震荡培养 10min，用全自动酶标仪测定波长490nm 处的吸光度(A 值)，连续检测 6d，记录 A 值。1.2.5 GFP 标记的 MSCs 的克隆培养 将 MOI 为 200 作用24h 感染的 MSCs 制成密度为 10 个/mL 的单细胞悬液。取 5mL 接种至已补加 DMEM 和 100
13、mL/L 血清的 90mm 培养皿中，轻轻晃动培养皿，使细胞分布均匀，置于培养箱中培养。16h 后，观察标记单个细胞。约 1 周后，单个细胞可形成 80100 个细胞的克隆集落。标记生长良好、荧光强度较强且周围较大范围内无其他细胞生长的单克隆集落。弃去旧培养基，用沾有少许灭菌凡士林的克隆环准确套6住标记的单克隆集落。于克隆环中消化细胞，将细胞悬液转移至预先加有完全培养基的 24 孔培养板中扩大培养。1.2.6 统计学分析 采用 SPSS17.0 统计软件进行统计处理，组间比较采用重复测量设计方差分析，组间两两比较采用Dunnettt 检验，显著性水平 =0.05。2 结 果2.1 MSCs 的
14、形态学特征及表面标志鉴定 第 2 代 MSCs 呈典型的成纤维细胞样形态，分布均匀(图 1)，其表达 CD54 和 CD90，不表达 CD34 和 CD456。在整个传代培养过程中，细胞始终保持其成纤维细胞样的形态和较强的增殖能力。2.2 慢病毒载体介导 GFP 感染 MSCs2.2.1 感染后 MSCs 形态变化 MOI 为25、50、100、200、400 作用 12h 及 MOI 为 25、50 、100 作用24h 的感染组未发现细胞死亡及细胞形态改变(图 2A)。作用24h，MOI 为 200 的感染组细胞形态基本无明显改变，偶见个别细胞呈中毒样改变(图 2B);MOI 为 400
15、的感染组可见部分细胞死亡，一些细胞胞体皱缩，表面粗糙，有颗粒样物质沉积(图 2C)。7A：MOI 为 100，细胞形态无明显改变;B ：MOI 为 200，细胞形态基本无改变，偶见个别细胞呈凋亡样改变;C：MOI 为 400，可见较多细胞死亡，部分细胞呈凋亡样改变。2.2.2 感染后 MSCs 中 GFP 的表达 感染后 4d，可见较弱的绿色荧光;6d 时 GFP 表达达到高峰，后维持在此高水平。感染后7d，MOI 为 25、50 、100、200、400 作用 12h 及 MOI 为25、50 作用 24h 的感染组感染率相对较低，且荧光强度较弱。作用 24h，MOI 为 100 的感染组感
16、染率超过 80%，MOI 为 200 和400 的感染组感染效率超过 90%，且荧光强度较强(图 3)。经流式细胞术分析，作用 24h，MOI 为 100、200 和 400 的感染组感染效率分别为 88.94%(图 4A)、99.65%(图 4B)和 98.88%(图 4C)，平均荧光强度分别为 194.87、818.38 和 586.79。2.3 GFP 感染对 MSCs 增殖的影响 感染后 16d，与未感染的 MSCs(MOI 为 0)相比，作用 24h，MOI 为 100 和 200 的感染组细胞生长速度无明显变化;MOI 为 400 的感染组细胞生长速度相对较慢，4d 后生长速度则明显加快。 MTT 检测结果显示：各组细胞在接种后 24h，开始进入明显的增殖期，MOI 为 400 的感染组，细胞增殖相对较慢，4d 后生长速度明显加快 (图 5)。经统计学分析，MOI 为 400 的感染组，相对未感染组细胞增殖较慢(P=0.001);MOInts
