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1、1慢性苯中毒患者外周血 TCR V亚家族 T 细胞分布和克隆性研究作者：李萡, 李扬秋, 陈少华, 杨力建, 余卫 , 刘薇薇, 陈嘉榆【摘要 】 目的: 了解慢性苯中毒患者外周血 T 细胞的 TCRV基因谱系及其克隆性增殖情况。 方法: 利用 RTPCR 方法扩增 10例慢性苯中毒患者外周血单个核细胞中 8 个 TCR V 基因的互补决定区 3(CDR3), PCR 产物进一步经荧光标记和基因扫描分析 CDR3长度而确定 T 细胞的克隆性。结果: 8 例健康人平均表达（6.630.52）个 V 亚家族, 外周血中未检测到 V4 和 V5 亚家族, 慢性苯中毒患者工人表达（ 1.10 0.57
2、）个 V 亚家族（1 例重度苯中毒工人 8 个 V 亚家族均未表达）, 外周血中未检测到V1、 V3、 V4 和 V8 亚家族, 与健康人比较有显著性差异（P0.01） 。6 例慢性苯中毒患者存在 12 个 V 亚家族 T 细胞出现克隆性增殖。结论: 慢性苯中毒患者外周血出现 TCR V 亚家族倾斜性分布和克隆性增殖 T 细胞, 这可能是苯中毒后所引起的机体特异性免疫反应。 【关键词】 苯 TCR V 基因 克隆性 T 细胞苯是目前应用最为广泛的化工原料和工业溶剂之一。有关慢2性苯中毒以及接苯所致再生障碍性贫血（AA）, 骨髓增生异常综合征（MDS）和白血病确切发病机制仍不明确1 。多项研究已
3、表明苯及其代谢物抑制 T 细胞的增殖而损伤机体细胞免疫功能, 人外周血 T 细胞主要表达 TCR+T 细胞（90%以上） , 我们前期工作发现苯接触人群和苯中毒患者的外周血 TCRV, V 亚家族 T 细胞表达和克隆模式发生改变2, 3, 提示苯对 T 细胞免疫可能存在的损伤。尽管外周血中仅存在少量的 TCR+T 细胞, 但对机体细胞免疫功能同样举足轻重。通过分析慢性苯中毒患者外周血 T 细胞中 TCRV基因各亚家族细胞的分布和克隆性增殖情况可以更为全面地了解慢性苯中毒患者 T 细胞的免疫功能变化。1 材料和方法1.1 材料 慢性苯中毒患者外周血标本 10 例, 其中男 4 例、 女 6 例,
4、 年龄 2048 岁, 平均年龄（30.58.6 ）岁, 工龄1.014.0 年, 平均(8.45.6)年; 健康人外周血标本 8 例, 其中男 5例、 女 3 例, 年龄 2440 岁, 平均年龄（30.86.2）岁, 慢性苯中毒患者标本由广州市第十二人民医院提供, 健康人外周血标本来源于本试验室工作人员。慢性苯中毒患者均有职业接苯史, 慢性苯中毒患者和健康人均无影响造血和免疫功能的基础疾患、 首次就诊3 个月内未使用影响造血和免疫功能的药物、 无癌症史、 放疗及化疗史、 无其他骨髓毒性化学物接触史和放射线接触史。10 例慢3性苯中毒患者中含 5 例慢性轻度苯中毒（编号 B15） 、 5 例
5、慢性重度苯中毒（含再生障碍性贫血 2 例, 编号 B610 ） 。1.2 方法1.2.1 RNA 提取和 cDNA 合成 RNA 提取应用 TRIzol 试剂盒（Invitrogen, USA）并应用随机引物和反转录酶试剂盒（PowerScriptTM Reverse, BD, USA）反转录合成 cDNA 第 1 链, 均按常规方法进行。1.2.2 引物设计 根据 TCR 的 8 个亚家族分别设计 8 个 V引物作为上游引物（V1 V8）作为上游引物并在 C 区设计一下游引物 C, 另外在 C 的引物上游再设计一荧光素标记的Cfam 引物作为标记 PCR 产物和基因扫描之用。引物均由德国柏林
6、 TIB MOLBIOL 公司合成（表 1） 4 。表 1 用于 TCR V 基因检测的引物序列（略）1.2.3 PCR 扩增 PCR 按已报道的方法进行5 。总反应体积为 20 L, 其中含 1 L cDNA、 任一 V 引物（8 个 V 引物之一）和 C 引物（ 0.5 mol/L） 、 0.1 mmol/L dNTP、 1 U Taq 聚合酶（Promega, USA ） 、 1.5 mmol/L Mgcl2 和 10PCR 缓冲液。4反应在 PCR 扩增仪（Biometra, Germany）中进行, 共进行 40 循环, 每一循环包括: 94 1 min（首次 3 min）, 60
7、1 min 和72 1 min（末次 6 min）, PCR 产物保存于 4中备用。1.2.4 T 细胞克隆性分析 10 L 的反应体系含 2 L 的未标记的 PCR 产物、 0.1 mol/L Cfam 引物、 1.5 mmol/L MgCl2, 0.2 mmol/L dNTP, 1 U Taq 聚合酶和 PCR 缓冲液。PCR共进行 35 循环, 退火温度为 66, 余同上。取 2 L 荧光素 Fam 标记的 PCR 产物加入高质量的去离子甲酰胺（HiDi Formamide, ABI）与标准品(Perkin Elmer GENESCANTM500LIZTM, ABI, 其中含有荧光素 L
8、IZ 标记的不同大小的 DNA 片段)按 201 比例配好的 10 L 混合液, 94变性 4 min, 然后将样品加入 96 孔板, 直接装载到已灌好 POP4（Performance Optimized Polymer4, ABI）胶的 3100 DNA 序列分析仪上进行电泳, 电泳所采集结果经基因扫描分析软件分析产物的长度和荧光强度。1.2.5 统计学分析 采用 SPSS11.5 统计软件进行相关统计分析。2 结果2.1 TCR V 亚家族 T 细胞的表达情况 8 例健康人经 8 个 5V 亚家族的 PCR 扩增后 , 分别可检测到 67 个 V 亚家族阳性产物, 平均表达 6.630.
9、52 个 V 亚家族, 10 例慢性苯中毒患者分别可检测到 12 个 V 亚家族阳性产物（1 例重度苯中毒患者 8 个亚家族均未检测到）, 平均表达 1.10 0.57 个 V 亚家族, 与健康人相比明显减少（P0.01, 图 1） 。8 例健康人除 V4 和 V5 亚家族未检测到外, 表达的 V 亚家族比较集中 V1、 V2 和 V3。10例慢性苯中毒患者样本中仅检测到 11 个 V 亚家族的 RTPCR 产物, V1、 V3、 V4 和 V8 亚家族均未检测到。轻度慢性苯中毒患者和重度慢性苯中毒患者之间 V 亚家族表达率无明显差异。图 1 TCR V 各亚家族在健康人和慢性苯中毒患者外周血
10、的表达情况（略）2.2 T 细胞克隆性分析结果 基因扫描分析结果显示 , 8 例健康人外周血中在不同亚家族中出现克隆性 T 细胞, 主要集中在 V1、 V2 和 V3, 9/10 例慢性苯中毒患者中分别有 12 个 V 亚家族多克隆模式发生了改变, 扫描分析呈现双克隆、 寡克隆增殖的图象。出现克隆性增殖改变的 V 亚家族分布在不同个体中 , 慢性苯中毒工人比较集中的趋势见于 V2 亚家族。3 讨论TCRV 基因包含可变区（V 区） 、 多样区（D 区） 、 结合区6（J 区）和恒定区（C 区） 。人类 TCR 基因位于 14 号染色体长臂上, 由 8 个 V、 2 个 D、 3 个 J 和一个
11、 C 基因片段组成。在TCRV 重排过程中由于选用不同的 J 区以及在各基因片段连接的过程中, 有不同数量的核苷酸（324 个）随机插入, 称为 N 区。因此在 V 区与 D 区、 D 区与 J 区的连接处, 均有不同数量核苷酸的N 区, 形成了一个 VNDNJ 序列的高变区, 称之为 CDR3 区。CDR3是识别抗原的区域, 不同克隆所形成的 CDR3 的长度和碱基序列不相同。特异性抗原刺激可使 TCR V 基因谱出现倾向性分布和克隆性增殖, 并预示着相应的功能改变。目前有关 TCR V 基因表达变化在自身免疫系统疾病, 血液系统肿瘤和一些实体瘤中的报道较多6, 7, 但尚未见慢性苯中毒患者
12、 TCRV 基因亚家族变化的相关报道。应用 RTPCR基因扫描方法分析 TCR V 8 个亚家族的CDR3 长度是近年国外新形成的研究方法。本研究中 8 例健康人经8 个 V 亚家族的 PCR 扩增后, 分别可检测到 67 个 V 亚家族阳性产物, 未检测到 V4 和 V5 亚家族。9 例慢性苯中毒患者可检测到 12 个 V 亚家族阳性产物（1 例重度苯中毒工人 8 个亚家族均未检测到）, V1、 V3、 V4 和 V7 亚家族均未检测到, 慢性苯中毒患者检出的亚家族的数量较健康人检出亚家族数明显减少（P0.01） 。与 TCR V 亚家族全部表达于正常人外周血 T 细胞的情况不同, TCR
13、V 亚家族在正常人外周血 T 细胞中的出现频率不7同, 部分亚家族也未能在外周血中检测到, 而出现频率较高的是 V1和 V2 家族, 本研究结果与既往文献报道相似。但在慢性苯中毒患者外周血中, TCR V1 亚家族 T 细胞未能检测到, 这种倾斜性分布可能与机体接苯后某些 V 亚家族表达受限 , 也可能是机体接苯后对相关抗原的一种直接反应从而引起机体中一些 V 亚家族的增殖而抑制了另外一些 V 亚家族表达 , 本研究所发现 TCR V 亚家族表达情况, 具体是何种原因引起值得探讨。在 8 例健康人外周血中检测到在不同 V 亚家族中出现克隆性 T 细胞, Shen 等 8在分析正常人外周血 T
14、细胞 TCRV1 和V2 表达中也有类似的报道, 并认为在正常人外周血中所出现的这种克隆性是 TCRV T 细胞的一种普遍特征。10 例慢性苯中毒患者外周血中在检测到的 V 亚家族中有 3 个亚家族发生克隆性改变 , 并且比较集中在 V2 亚家族, 尽管在 8 例健康人中也检测到 V2 亚家族发生克隆性改变, 但二者之间发生克隆性改变的 V2 亚家族中选用的 J 区以及 CDR3 区是否相同仍需下一步通过对 CDR3 区序列进行分析才能明确。TCR T 可以通过 MHC 非限制性方式识别多种抗原, T 细胞所识别的抗原谱与 T 细胞有明显不同, 从而与T 细胞在功能上具有互补性9 。慢性苯中毒
15、患者 V5 和 V7亚家族的克隆性改变在健康人中未发现, 尤其是在健康人中未检测到 V5 亚家族表达。本研究中慢性苯中毒患者 V5 和 V7 亚家族的克隆性增殖有可能与机体接苯后对相关抗原的的一种特异反应相8关。总之, 本研究结果首先提供了慢性苯中毒患者外周血中TCRV 亚家族 T 细胞表达和克隆模式变化的情况, 为机体接苯后 T细胞免疫功能改变补充了新资料, 有关 TCRV 亚家族 T 细胞分布和克隆性改变的发生机制有待进一步研究。【参考文献】1 陈嘉榆, 刘薇薇, 黄振倩, 等. 苯接触工人外周血 T 细胞受体 TCR V 亚家族基因多态性分析J . 中国工业医学杂志, 2003, 16(3): 148-151.2 李 萡, 李扬秋, 杨力建, 等. 接苯工人外周血 TCR V 基因谱系和克隆性分析J. 中国劳动卫生职业病杂志, 2007, 25(10): 590-593.3 陈嘉榆, 刘薇薇, 陈玲珍, 等 . 苯致再生障碍性贫血患者 T 细胞受体 V 亚家族基因的表达 J. 中华劳动卫生与职业病杂志, 2006, 24(1): 59-60.4 Evans PS, Enders PJ, Yin C, et al. In vitro stimula
