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1、血清感染性疾病标志物筛检中应重视的若干问题李金明血液筛查质量的高低，直接关系到受血者的安全。目前。国内采供血机构针对感染性疾病病原体筛检的标志物共有 4 种，即乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、丙型地炎病毒抗体（抗 HCV）、人免疫缺陷病毒抗体（抗 HIV）和梅毒抗体。主要采用酶联免疫明附试验（ELISA）方法检测。方法模式有一步双抗体夹心法、间接法和一步或两步双抗原夹心法等。所使用的仪器设备主要有酶标洗板机、全自动酶免疫分析系统和全自动加样系统等。尽管国内采血机构的血液筛查检测质量在不断提高，但在不同层次的采血机构，仍不同程度的存在一些时常困扰基层实验室工作人员的的问题。一、 ELISA
2、测定的“灰区”问题1，2血液筛查中的 ELISA 测定是一种定性测定，必须在“阳性”与“阴性”之间有一条明确的分界线，也就是所谓的“阳性判断值”（Cut-off），这是定性免疫测定结果的报告的依据，在定性免疫测定中，确定合适的阳性判断值对减少假阴性具有重要意义。而阳性判断值的上移可下移，可导致假慢性或假阴性结果的出现。通常阳性判断值，是将大量阴性和阳性的测定数据进行统计分析后确定的。其确定依据为测定的“灰区”。“灰区”的大小可用统计学方法确定。测定结果处于“灰区”的样本，可通过确认试验或追踪检测来确定到底是阳性还是阴性，这一点对于临床病人标本的检测不是什么问题，但在血站筛检献血员及正常人群体检
3、时，就必须对这个问题加以注意。对于测定吸光度值（A）低于但接近 Cut-off 值的血液是否可输给受血者，ELISA“灰区”到底有多太？这一点常使血站工作人员感到困惑。因此，用于血液筛查检测的 ELISA 试剂盒有必要确定一个“灰区“的下限。尽管这样可能会导致一些正常血液的废弃，但对于保证输血安全极有意义。二、“钩状效应“（Hook effect）问题3，4“钩状效应“系指在一步法 ELISA 中，测定显色随着待测标本中抗析或浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原或抗体浓度的增加而开始下降直到不显色，而出现假阴性结果的问题。在免疫沉淀试验中又称为”带现象“（Zone phenomen
4、on）。在血液筛查中，有中能因”钩状效应“的存在而出现假阴性的主要是 HBsAg 和抗 HIV 的检测。目前，国内 HBsAg 的检测均为一步双抗体夹心法，抗 HIV 有一些采用了双抗原夹心法，尽管试剂行产厂家在固相和标记抗体或抗原的选择匹配上，采取了结合位点远离或含多个可结合位点的方法，在很大程度上，可以避免或减轻“钩状效应”，但如果某一批试剂处理不好或是特定的标本，仍有可能出现由“钩状效应”所致的假阴性，解决“钩状效应”的最好办法，就量采用两步法试剂盒，其次就是对每一批试剂盒使用前，采用能得到的最强阳性的标本，进行有关“钩状效应”的质检。三、 病毒变异的所致的假阴性问题病毒变异所致的假阴性
5、主要表现在 HBsAg 的检测。HBV 的 S 基因负责编码表达表面抗原，即 S 蛋白，任何影响 S蛋白表达水平或其抗原性的突变，都可能导致表面抗原检测出现阴性结果5-9。特别是负责编码表面抗原“a”决定簇的序列发生改变，表面抗原“a”决定簇是主要抗原决定簇，为各亚型所共有，位于高度保守的表面抗原第 124127位氨基酸的新水区，此区富含半胱氨酸并借位于第 124、137、139 和 147 位间的二硫键形成双环结构，从而维持表面抗原的抗原性，所以，此区哪怕仅 1 个氨基酸发生突变，也会影响表面抗原的抗原性，使其抗原性发生改变，或者表达下调节器，甚至不表达。从而使得常规试剂检测为 HBsAg
6、阴性，由此可见，HBsAg 检测阴性的血液中，仍可能有一定比例铁 HBV 感染血液。目前，国外普遍检测抗 HBc，因 HBsAg 检测阴性的 HBV 感染者中，单项抗 HBc 阳性的病人中比例是最高的，考虑到国内的乙肝病毒感染率远高于国外，因此，尤有必要对 HBsAg 检测阴性所致的 HBV 输血感染问题引起重视，并进行必要的研究探讨，从而采取相应的措施，如病毒核酸检测等，以降低经输血传播 HBV 的可能性。四、试剂盒的质检、初检和复检试剂的选用现在，国内用于血液筛查的试剂盒，尽管已有批批检，但不同厂家不同批号的试剂盒在用于特定标本检测的时候，结果仍可能有差异，此外，试剂盒从厂家到用户手中，还
7、会出现运输和贮存过程中对试剂盒质量有影响的问题，因此，试剂盒在使用前必须进行质检，质检的重点包括试剂盒有效期、测定下限、抗干扰能力以及对特殊标本的检出能力等方面。目前，血站在血液筛查时，有初检和复检两次检测，分别使用不同厂家的试剂盒进行，如何选择初复检试剂，也是值得注意的一个问题。比如，HCV 感染者血循环中存在针对 HCV 不同蛋白的抗体，而具有针对某种蛋白的抗体是否出现、出现的时间、持续时间长短均有所差异，因此 ELOSA 测定时所使用的包被抗原必须全面，才能有效地检出所存在的抗体10，11。但在实际工作中，由于不同的抗 HCV ELISA 试剂盒生产厂家所使用的 HCV 抗原的来源、质量
8、及包被浓度各有差异，使测定中对同一份样本所测定的结果有时会出现很大的差异，尤其是对较弱的阳性的样本或仅出现针对 HCV 单个蛋白万分的抗体的样本。因此，在选择初检和复检试剂时，最好选择在测定不同的 HCV 蛋白抗体有互补的试剂盒，从而最大程度的避免漏检。五、仪器设备的使用、维护和样准12-14在血注信息筛查的 ELISA 测定中，可能会涉及到的仪器设备主要有加样器、温育仪、洗耳恭听板机或全自动酶免分析系统及全自动加样系统等。微量加样器是微量酶免疫手工加样器的使用往往只有简单的了解，而校准则基本没有，或没有微量加样器还需定期校准及怎样校准的意识。温痛是 ELISA 测定中影响测定成败的最为关键的
9、一个因素，ELISA 作为一种固相免疫测定。抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使所需的时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。 温育仪内温度的均一性和恒定性非常重要。温育仪通常有恒温箱、水浴箱和其他一些新出现的温育装置，如酶免疫测定加速仪等。普通恒温箱如果采用空气浴，酶标板孔放在恒温箱内不同位置，温度有可能会有数度之差。因此。测定时应尽可能采用水浴，或采用温度恒定均一的温育仪，并且每次使用前都要用经过校准的温度计进行温度校准。作为微孔板比色计的酶标仪，其基本功能不在乎一个比色测定，所不同的是在测定波长范围、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量测定软件功能待方
10、面的差异，当然全自动酶免疫分析系统还具有自动洗板、温育、加样等功能。在实际工作中，实验人员在使用酶标仪进行测定操作时，有时难免会对酶标仪的一些性能指标产生迷惑，甚至对酶标仪的应用产生错误的理解。如使用酶标仪较用肉眼观察测定的阳性率明显增加这样的问题；还有比较常见的单、双波长检测应用和测定空白设置的问题等。酶标仪必须使用标准滤光片或有色溶液定期进行校准。洗板机经过数十年的发展，由最初的简单的多头吸液和加液系统，发展到了今天的融合多种洗涤功能的全自动洗板机，如震荡、涡流、底部冲洗、两点吸液、连续式冲洗等多种功能方式，并且还可根据冲洗压力、冲洗在使用前后都必须进行充分的冲洗，以防止管道的堵塞。全自动
11、加样系统应用中的最大问题是标本间的交叉污染，即“拖带”现象。因此，必须采取措施，如使用一次性吸头，充分冲洗或用适当的冲洗液和制定冲洗程序等，以防止这种现象，否则，均不能用全自动加样系统。六、检测程序的规范化和室内质量控制15-17在目前的血液筛查中，初检和复检通常同时进行。当发现其中一次检测为阳性时，就再次双份检测，如为阴性，即血液合格。这种做法，有很大的法律风险，因为就目前的技术而言。即使是检测合格的血液，也不能 100%保证安全。因此，如上述出现过 HBsAg、抗 HCV、抗 HIV 和梅毒抗体阳性的血液输入受者后造成输血后感染。采供血机构是无法自圆其说的。因此，有必要对血液筛查的检测及报告程序作进一步的规范。由于血液筛查中 ELISA 为定性测定，且不同厂家或同一厂家不同批试剂盒间测定下限均有差异，因而实验室对如何选择合适的质控物及质控图的连续性问题均经常感到困惑。通常质控物浓度选择 S/CO 比值在 24 之间较为合适。此外，还应选择 1 份 S/CO 值在 1 .01 .5R 的质控样本，以监测试剂方法测定直限的有限性，对于质控图在不同批试剂间的边续性，则可通过不同批试剂间同一浓度质控物 S/CO 值的换算方式完成。
