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1、1慈菇消脂丸对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的防治作用作者：马燕花，杨少军，赵建雄【摘要 】 目的 观察中药慈菇消脂丸对大鼠非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的防治作用。方法 建立非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型，随机分为正常组、模型组、慈菇消脂丸高剂量组、慈菇消脂丸低剂量组、东宝肝泰阳性药物对照组，观察肝组织病理形态学的变化，检测肝组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶 (SOD)、一氧化氮(NO)的含量。免疫组化技术检测环氧合酶2(COX2) 及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在肝脏的表达。结果 模型组大鼠肝组织出现脂肪变性及不同程度的炎性细胞浸润，镜下可见肝细胞内大量脂滴。与正常组相比较，模型组大鼠肝组织内
2、 SOD 活性显著降低，MDA、NO 含量显著提高，COX2 、iNOS 蛋白表达显著提高，差异具有统计学意义；与模型组相比较，中药治疗组大鼠肝组织内 SOD 活性显著提高，MDA、 NO 含量显著降低，COX2 、 iNOS 蛋白表达显著降低，差异具有统计学意义；中药慈菇消脂丸高剂量组作用亦较阳性药物对照组显著。结论 慈菇消脂丸对大鼠非酒精性脂肪性肝炎具有明显的防治作用，其作用机制与改善肝组织脂肪变性程度、抑制脂质过氧化、抗炎有关。 【关键词】 非酒精性脂肪性肝炎；慈菇消脂丸；环氧合酶2 ；2诱导型一氧化氮合酶；一氧化氮ABSTRACT: Objective To observe the p
3、reventive and therapeutic effects of Sagittara Sagittifolia L. XiaoZhi Pills on nonalcoholic steatohepatitis (NASH) in rats. Methods Rat NASH models were established and the rats were divided randomly into five groups: the normal group, model group, highdosage group and lowdosage groups of the treat
4、ment, and Dongbao Gantai positive drug group. Histopathological changes of the liver were observed. The levels of MDA, superoxide dismutase (SOD), and NO (nitric oxide) in the liver homogenate were determined. Expressions of cyclooxygenase2 (cox2) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the li
5、ver were determined with immunohistochemical technique. Results In model group, extensive adipose degeneration and inflammatory cell infiltration were found in the liver. Compared with those in normal group, SOD activities in model group were obviously decreased (P0.01), the contents of MDA and NO w
6、ere obviously increased (P0.01), and the expressions of cox2 and iNOS proteins were obviously increased (P0.01). Compared with those in model group, the activities of SOD in 3treatment groups were obviously increased (P0.01), the contents of MDA and NO were obviously decreased (P0.01), and the expre
7、ssions of COX2 and iNOS proteins were obviously decreased (P0.01). The effect of highdosage group was more obvious than that of Dongbao Gantai group (P0.05). Conclusion Sagittara Sagittifolia L. XiaoZhi Pills can effectively prevent and treat nonalcoholic steatohepatitis in rats, and its mechanism m
8、ay be associated with ameliorating hepatocellular steatosis, removing the free radicals and enhancing the antioxidation and antiinflammation capability.KEY WORDS: nonalcoholic steatohepatitis; Sagittara Sagittifolia L. XiaoZhi Pills; cyclooxygenase2; inducible nitric oxide synthase; nitric oxide1980
9、 年，LUDWID 等1首先提出了非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)的概念，是以无过量饮酒史以及肝细胞脂肪变性、气球样变、弥漫性肝小叶炎症和(或)肝中央静脉、肝窦周围胶原沉积为特征的慢性肝脏疾病。发病机制至今尚未明确，DAY 和 JAMES 等2根据动物实验的结果提出两次打击学说。目前缺乏有效的防治手段。脂肪肝属祖国医学“肥气” 、 “癥瘕” 、4“积聚”范畴，肝郁、痰湿、瘀血、浊毒为其主要发病机制。本文拟通过动物实验探讨中药慈菇消脂丸对非酒精性脂肪性肝炎的防治作用及其可能的机制。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物雄性 SD
10、大鼠， SPF 级，体重 200240g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK2004006 。1.1.2 实验药物慈菇消脂丸由山慈菇、泽泻、柴胡、生山楂、决明子、甘草等 10 味药物组成，甘肃中医学院附属医院制剂中心提供，生产批号：071217 。东宝肝泰片，由通化东宝药业股份有限公司提供，批号：070508 。普通饲料和高脂饲料由北京可澳协力饲料有限公司提供。1.1.3 主要的试剂和仪器5超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、微量丙二醛(MDA) 测定试剂盒、NO 试剂盒由南京建成生物工程公司提供。 Sp9001 兔 SP 免疫组化试剂盒由北京金桥中杉公司提供。Rabb
11、it antiCOX2 一抗、Rabbit antiiNOS 一抗、 DAB(显色剂)购自武汉博士德生物工程有限公司。DZW4 型恒温水浴箱，金坛市恒丰仪器厂。BP211D 型电子天平，Sartorius 公司。PLCO 型台式高速离心机，德国Heraeus 公司。UNICOUV2102C 型紫外分光光度仪，日本岛津公司。1.1.4 高脂饲料配方普通饲料 82.5%，10%猪油，2%胆固醇，0.5%胆酸钠，5%蛋黄粉。1.2 方法1.2.1 大鼠脂肪肝模型的建立3与给药方法 50 只 SD 雄性大鼠随机分为 5 组，每组 10 只，分别为正常对照组、模型对照组、慈菇消脂丸高剂量组、慈菇消脂丸低
12、剂量组、阳性药物对照组。正常组普通饲料喂养，其余 4 组均采用高脂饲料6喂养，同时按大鼠体重 2mL/kg 400g/L 四氯化碳豆油溶液，皮下注射，每周 2 次。造模 4 周后，四氯化碳模型组分为高剂量给药组，给药剂量为 1.6g/kg，给药体积 10mL/kg 大鼠；低剂量给药组，给药剂量为 0.80g/kg；阳性给药组，给药剂量为 0.32g/kg；模型对照组给予同体积生理盐水。连续给药 30d 后解剖所有大鼠，取出肝脏，称重，迅速从肝左叶中部切取一小块肝组织，按常规制备石蜡切片保存备用。1.2.2 检测体重、肝脏指数麻醉动物后称量体重、肝重，并计算肝脏指数(肝湿重/ 体重100%)1.
13、2.3 生化指标测定取肝右叶约 0.5g，4 下制成 100g/L(10%)肝匀浆， 分别测定 SOD、MDA、NO。按照试剂盒说明书操作。1.2.4 肝脏组织 HE 染色取肝左叶组织，100mL/L 中性福尔马林固定，石蜡包埋，5m 切片，HE 染色后在显微镜下观察肝组织的病理学变化。71.2.5 免疫组化染色检测 COX2、iNOS 表达采用链霉菌抗生物素蛋白 过氧化物酶免疫组化法(SP)。肝组织石蜡切片常规脱蜡至水，用高温进行抗原修复，30mL/L 过氧化氢灭活内源性酶后，50g/L BSA 封闭 20min，滴加不同浓度特异性一抗后 4过夜，次日滴加偶联二抗，室温 30min 后 DA
14、B 显色，苏木精复染，透明，封片。每次实验均设阴性对照，以 PBS 缓冲液代替一抗，结果显示阴性。1.3 统计学处理采用统计软件 SPSS11.0 进行统计学分析，数据以均数标准差(s)表示，显著性检验采用单因素方差分析，检验水准为0.05，差异有统计学意义。2 结 果2.1 各组大鼠肝脏指数、肝组织 SOD 活力、MDA、NO 含量的比较 模型组肝脏指数较正常对照组显著增加(P0.01)；与模型组相比较，中药高剂量组及阳性药物对照组肝脏指数均明显下降8(P0.05)；中药治疗组与阳性药物组之间亦无明显差异(P0.05)。与正常组相比较，模型组大鼠肝组织内 SOD 活性显著降低(P0.01)
15、，MDA、 NO 含量显著提高(P0.01)，差异具有统计学意义；与模型组相比较，中药治疗组大鼠肝组织内 SOD 活性显著提高(高剂量组 P0.01，低剂量组 P0.05)，MDA、 NO 含量显著降低(高剂量组 P0.01，低剂量组 P0.05)，差异具有统计学意义；除 NO 外，其他指标中药慈菇消脂丸高剂量组作用均较阳性药物对照组显著(P0.05，表 1)。表 1 慈菇消脂丸对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏指数、肝组织 SOD、MDA 、NO 含量的影响（略）2.2 肝组织病理学的变化给药 30d 后解剖，肉眼观察正常对照组大鼠肝脏为红色，边缘锐利，表面光滑，模型组肝脏明显肿大，呈黄色缺血状。给药
16、各组肝肿大有所缓解，颜色变红。HE 染色镜下观察，正常对照组肝小叶结构完整，肝细胞呈多边形围绕中央静脉呈放射状，肝窦清晰可见，肝索排列整齐。CCl4 模型组肝小叶结构破坏，肝细胞弥漫性脂肪变性，脂滴大小不等，部分融合为大脂滴，界限不清。肝索紊乱，少数可见点状坏死，碎霄样坏死和炎性细胞浸润。中药高剂量组肝小叶结构完整，脂肪变性细胞数目明显减少，反见一些细小脂滴散布于细胞内，肝索排列整齐。中药低剂量组肝小叶结构尚清晰，脂肪变性细胞数目明显减少，胞浆内脂滴减少或消失，反见一些细小9脂滴散布于细胞内，偶见个别大脂滴，肝索排列整齐。阳性药物对照组表现同中药高剂量组(图 1)。2.3 肝组织 COX2、iNOS 的表达阳性细胞为胞浆或核膜呈棕黄色或棕褐色颗粒。COX2、iNOS 主要表达于血管内皮细胞及肝小叶中央静脉周围的肝细胞、枯否细胞内。在 20
