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1、蛋白质组学技术瘤诊断中的研究摘要:蛋白质组学是以生物体系整体蛋白质为研究对象,以双向凝胶电泳和质谱技术为核心,旨在研究蛋白质表达谱和蛋白质与蛋白质之间相互作用的新领域,已被广泛应用于疾病的相关研究。随着后基因组时代的到来,运用蛋白质组学技术对肿瘤的研究已经成为人们关注的焦点。本文着重就蛋白质组学及其在肿瘤诊断中的应用予以综述。关键词:肿瘤; 蛋白质组学技术 ;研究蛋白质组(Proteome)的概念是由澳大利亚学者 Wilkins 和 Willian 于 1994 年提出,是指一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质。也可以说是指细胞或组织或机体全部蛋白质的存在及其活动方式。随着人类基因组计划
2、的成功实施,人类初步掌握了自身的遗传信息,但是虽然基因是遗传信息的携带者,而生命活动的执行者却是蛋白质。人类基因组测序结果表明,仅需 3.03.5 万个活性基因便可维持人类正常的生理功能1基因的表达的 mRNA 与最终的蛋白质之间并没有像当初设想的那样存在着严格的线性对应关系。从 mRNA 到蛋白质,受蛋白质翻译的调控、糖基化、磷酸化等诸多因素的影响,使得最终产生的蛋白质数目远超过活性基因的数目,如此有限和相对稳定、均一的基因组与蛋白质表达的多样性、动态性形成鲜明的对比;同时蛋白质的翻译后修饰、转运定位、结构形成、蛋白质之间相互作用等问题,也是基因组学所不能回答的2,而它们的变化往往和疾病的发
3、生有关 ,通过对正常及病理个体之间的蛋白质组比较和分析,从中辨认出某些疾病的特异性蛋白质分子,极可能成为设计新药物的分子靶点,并为疾病的早期诊断和预后提供分子标志。因此,要揭示整个生命活动的规律,就必须研究基因的产物蛋白质。以研究一种细胞、组织或完整生物体所拥有的全套蛋白质为特征的蛋白质组学自然就成为生命科学研究的新热点。蛋白质组学研究能动态、整体、定量地考察疾病发生发展过程中蛋白质种类、数量的改变，有助于研究者寻找到疾病诊断和预后的特异性标志物以及药物治疗的靶标。因此，蛋白质组学研究从一开始就在生物医学领域得到了广泛的应用，尤其是在恶性肿瘤的研究方面，已形成了一个“肿瘤蛋白质组学” 。肿瘤蛋
4、白质 组学研究近年己开始启动，如对肝癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、鼻咽癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、神经母细胞瘤等多种实体肿瘤，国内外均进行了一定的研究，并取得了一些有意义的结果。尤其是对危害较大的肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌等的研究比较深入。肝癌是我国东南沿海地区及东南亚国家高发的恶性肿瘤之一，我国(尤其是上海地区) 在肝癌的病因、发病、早期诊断和治疗方面一直居世界前列，因此中国科学院上海生化所在开展肿瘤蛋白质组学研究时选择了肝癌作为主要方向18。龙云铸3 等应用双向凝胶电泳和质谱技术 ,分析乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌 HCC 癌组织与癌周肝硬化组织之间的蛋白质组差异 ,鉴定
5、其中的差异蛋白质点 ,发现有表达水平存在显著差异的蛋白质点 35 个 ,14 个差异蛋白质点得到了初步鉴定 ,其中癌组织凝胶中表达明显的蛋白质有 8 个;在癌组织中表达明显降低而在肝硬化组织中增强的蛋白质有 6 个。这为进一步阐明肝癌的发病机制和早期诊断,奠定了良好的实验基础 ,可能有助于癌变机制、肿瘤标记和治疗靶标的进一步研究。新加坡学者 socw 等也利用双向凝胶电泳、 MALDI-OF-MS 或电喷雾离子化串联质谱(NanoelectrsPary ioniaztoin MS/MS)技术鉴定了一株乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性的肝癌细胞系 HCC-M 中表达的蛋白质，建立了该细胞系
6、的蛋白质数据库，并开展了肝癌组织蛋白质组的初步研究 4。PardaiS V 等用表面加强激光解吸电离飞行时间质谱研究了44 例肝硬化并肝癌和 38 例肝硬化无肝癌患者的血清，发现一个特异峰，并纯化了这个8900D 的物质。研究发现这个标志物是 S 蛋白的一个片段，可以作为肝癌和肝慢性病区别的一个分子标志物21。肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，近年来肺癌的发病率上升很快目前己占城市恶性肿瘤死亡率的首位，严重威胁人民的生命和健康。Zhang J 等利用噬菌体抗体库筛选分离除了针对肺癌细胞系 A549 新的抗体 AFAI，为 AFAI 带上药物定向杀死癌细胞提供了基础 5。Garus 构建了转移
7、淋巴结 Fab 抗体库，并用活细胞的 HuD 抗原进行筛选6 。岳文涛等扩增鼠杂交瘤抗体构建了抗人肺癌单抗 5F-11 噬菌体抗体库，并用人肺癌细胞系A2 进行了筛选，并制备了可溶性的抗体，将抗体与阿霉素形成免疫复合物在体外进行了肺癌细胞的杀伤作用研究。结果表明研究者成功构建了抗人肺腺癌 ScFv 噬菌体抗体库，并从抗体库中制备了 5F-11 可溶性单链抗体，与阿霉素形成免疫复合物后对肿痛细胞的杀伤力大大提高，目前研究者正在进行此免疫复合物的动物体内作用，有很好的临床应用前景7。Xiao 等利用表面加强激光解析电离蛋白芯片技术(SELDI)检测了 30 个肺癌和 51 个年龄性别匹配的健康人的
8、血清，检测的灵敏度和特异度分别为 93.3%和 96.7%，表明血清可以用来发现肺癌的特异生物标志物，SELDI 是一个可以用于分子诊断的有用的工具25 。 卵巢癌发生率在女性生殖系统肿瘤中占第 3 位 ,低于宫颈癌和宫体癌 ,但死亡率却最高8。研究表明，美国每年因卵巢癌死亡的妇女可达 16 000 余例 ,即便术后长期化疗 ,其五年生存率仍然只有 20% 30%。因此 ,研究卵巢癌的发病机制、分类、早期诊断标记物及治疗方法等具有十分重要的意义 ,而蛋白质组学在肿瘤的各方面研究中具有十分独特的优势。JoneS 等9 使用 2-DE 分离激光捕获显微切割(LCM)获得的侵袭性卵巢癌和非侵袭性低度
9、恶性卵巢癌的上皮细胞标本，发现 52kDa 的 FK506 结合蛋白、Rho C 蛋白分离抑制因子(Rho C 一 protein dissociation inhibitor，Rho CDI)和乙二醛酶 I( glyoxalase I)在侵袭性卵巢癌中明显高于非侵袭性低度恶性卵巢癌，认为这些蛋白质有可能成为侵袭性卵巢癌的诊断标志物和治疗的靶标。Petricoin 10利用蛋白质芯片和表面增强激光解吸离子一飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术对 50 名卵巢癌和 66 名非癌患者或健康人的血清标本进行盲法检测，所有癌症病人全部检出，66 例非癌标本，检出 63 例。灵敏度达 100%，
10、特异性达 95%，阳性预测值为 94%，而同样的标本，利用 CA125 检测，阳性预测值仅为 35%。Conrads 等人11用 SELDI 四极杆串联飞行时间质谱(Qq-TOF-MS) 对 43 例健康妇女和 68 例卵巢癌病人血清标本进行分析并取得了可喜的结果，18 例卵巢癌 I 期病人的阳性率达到了 100%，灵敏度和特异度均到达到了 100%，这在以前是从未报道过的。并发现在质荷比(m/z) 为7060.121 和 8605.678 的特征峰可以正确地诊断卵巢癌。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一 ,据统计每年全球有 100 万新发病例 , 因此探讨乳腺癌的发生、发展机制 ,寻找新的生物
11、分子靶标 ,对乳腺癌的防治具有重要意义。Li等13也进行大规模的筛查研究，检测了 169 份妇女的血清（其中 103 位乳腺癌病人、25位为良性瘤、41 位为健康对照） ，先用免疫金属亲和层析-镍芯片（IMAC-Ni chip）进行捕获，最后用 ProPeak software 软件进行分析，最后得到癌症病人和健康人鉴别诊断的灵敏度为 93%，特异性为 91% ,就可能以此为靶点设计联合用药的新方案 。Adam13等通过比较乳腺癌和乳腺正常组织的蛋白质组发现一种在乳腺癌中高表达的蛋白质 N-乙酰基转移酶 -1( N-acetyltransferase-1,NAT-1) 。同时发现表达 NAT-
12、1 的乳腺正常上皮细胞比不表达 NAT-1 的乳腺正常上皮细胞不仅具有较快的生长特性 ,而且还具有较高的抗足叶乙甙的能力 ,这无疑为抗乳腺癌药物的研制提供了一个新的靶点。 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一 ,据统计每年全球有 100 万新发病例 , 因此探讨乳腺癌的发生、发展机制 ,寻找新的生物分子靶标 ,对乳腺癌的防治具有重要意义。Li等13也进行大规模的筛查研究，检测了 169 份妇女的血清（其中 103 位乳腺癌病人、25位为良性瘤、41 位为健康对照） ，先用免疫金属亲和层析-镍芯片（IMAC-Ni chip）进行捕获，最后用 ProPeak software 软件进行分析，最后得到癌
13、症病人和健康人鉴别诊断的灵敏度为 93%，特异性为 91% ,就可能以此为靶点设计联合用药的新方案 。Adam13等通过比较乳腺癌和乳腺正常组织的蛋白质组发现一种在乳腺癌中高表达的蛋白质 N-乙酰基转移酶 -1( N-acetyltransferase-1,NAT-1) 。同时发现表达 NAT-1 的乳腺正常上皮细胞比不表达 NAT-1 的乳腺正常上皮细胞不仅具有较快的生长特性 ,而且还具有较高的抗足叶乙甙的能力 ,这无疑为抗乳腺癌药物的研制提供了一个新的靶点。 前列腺癌是西方国家最常见的恶性肿瘤 ,近年在我国的发病率也明显上升。血清前列腺特异性抗原 (prostaticspecificant
14、igen,PSA) 一直是前列腺癌早期诊断的肿瘤标志物 ,尽管 PSA 认为是前列腺癌目前最好的肿瘤标记物，但其检出率低 ,且常出现假阴性和假阳性。经常导致不必要的活检和损伤。如何提高前列腺癌筛查试验的特异性成为急待解决的问题。Wright Jr 等在 1999 年首次用 SELDI-TOF-MS 建立起了快速、灵敏，可同时检测四种肿瘤相关标志物的方法。后来又用免疫加 SELDI-TOF-MS 方法测定了前列腺特异性膜相关抗原 （prostate-specific membrane antigen,PSMA） 。当用表面有前列腺特异性膜相关抗原的抗体芯片去捕获时，结果发现在用 PSA 不能正确
15、地诊断时，PSMA 可很好地对良性和恶性进行鉴别诊断17。Ornstein 等18利用比较蛋白质组学技术对 3 例根治性切除的前列腺癌标本进行蛋白质组分析,发现 2 例标本中有 6 个只在恶性细胞中表达的蛋白质及 2 个只在良性上皮细胞中表达的蛋白质,这些蛋白质在间质细胞中不表达,具有较高的细胞特异性,有可能作为临床治疗靶点和肿瘤血清标志物。 胃癌在恶性肿瘤的死因中仍然占有重要地位，近年来利用蛋白质组学对胃癌的研究也日新月异，对胃癌发生发展中各个相关蛋白所起的作用也有了新的认识。贾继辉19 等运用固相 PH 梯度双向凝胶电泳等技术 ,筛选出猴病毒 40 转化的人胃黏膜上皮细胞 GES-1，与人
16、胃癌细胞 MGC-803 间若干与肿瘤发生密相关的差异表达蛋白质。MALDI-TOF-MS 技术进行质谱分析后 ,得到 17 个 GES-1 和 MGC-803 细胞间表达差异蛋白质的明确信息 ,涉及细胞骨架、细胞调控、细胞凋亡和生物氧化等种类蛋白质。发现 MGC-803 细胞骨架中的波形蛋白和原肌球蛋白 3 表达量显著下降 ,而 MGC-803 细胞凋亡抑制和增殖相关蛋白表达量上升展机制 ,进而为胃癌的早期诊断和防治提供依据。该研究还发现 ,MGC-803 细胞 MHC I 型抗原表达下降。这些差异蛋白分析有助于深入研究胃癌的发生发展机制 ,进而为胃癌的早期诊断和防治提供依据。LeeK 通过对胃癌患者胃液的研究发现，alph(a1)一 nattiPyrsin 有可能是一个胃癌诊断和预警的标志物20。 鼻咽黏膜上皮细胞来源的恶性肿瘤，是南方发病率最高的十大恶性肿瘤之一 ，也是最常见的头颈部恶性肿瘤。中南大学湘雅医学院肿瘤研究所与湖南师范大学生命科学院
