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1、1小鼠窦前卵泡的玻璃化冷冻方法研究作者：常娟娟， 江一平， 王明权【摘要 】 目的 对性成熟前小鼠的窦前卵泡采用不同的方法进行玻璃化冷冻，探讨不同冷冻方法对卵泡复苏率的影响。 方法 用型胶原酶和脱氧核糖核酸酶分离 1014 d ICR 雌鼠的卵巢，共进行 A、B 两个实验，每次实验对获得的卵泡分为 4 组，1 组作为新鲜对照组，其余 3 组采用不同的冷冻方法处理,试验 A 采用常规玻璃化法、205 玻璃化法和液氮网篮法；试验 B 采用205 玻璃化法、液氮网篮法和205 表面玻璃化法，卵泡复苏后进行台盼蓝染色，计算各组卵泡复苏率。 结果 液氮网篮和205 玻璃化冷冻的冷冻效果一致，两种方法的卵
2、泡复苏率差别无统计学意义；常规玻璃化的冷冻效果最差，205 表面玻璃化冷冻的冷冻效果最好，其冷冻小鼠窦前卵泡的复苏率达(83.024.10)%。 结论 205 表面玻璃化是一种较好的冷冻窦前卵泡的方法。 【关键词】 卵泡；卵子；冷冻；组织保存；小鼠，近交 ICRABSTRACT: Objective To investigate the influence of different methods on the recovery rate of preantral follicle of immature mice after they were treated with vitrificat
3、ion and 2freezethawing. Methods Collagenase I and DNase I were used to separate the ovarian tissue of the ICR female mice(1014 d of age).Two experiments (A and B) were carried out,in each of which the follicles obtained after cleaning were divided into four groups,one as a control group,the other th
4、ree groups given vitrifiable cryoprotection with different methods.In Experiment A,conventional vitrification,205 vitrification and metal net were used,while in Experiment B, 205 vitrification,metal net and 205 surface vitrification adopted.After recovery, follicles were stained with trypan blue, an
5、d the recovery rates were calculated. Results In the two experiments，the effect of metal net and 205 vitrification are consistent.There were not significant differences between them.The effect of conventional vitrification was the worst.In addition,the effect of 205 surface vitrification was the bes
6、t,with a recovery rate of (83.024.10)%. Conclusion 205 surface vitrification is a desirable way to freeze preantral follicles.KEY WORDS: ovarian follicle;ovum;freezing;tissue preservation;mice,inbred ICR3卵巢组织、细胞的冷冻保存技术是生殖工程的重要内容之一，可为体外授精、显微授精和体细胞核移植等需要储备和供应卵源的实验提供技术保障1。在既往的研究中，冷冻复苏的卵母细胞和卵巢组织都有部分能够发育
7、到囊胚或者生育幼仔26 ，说明冷冻复苏后的卵母细胞及或各级卵泡保持了正常的发育潜能。但采用常规程序冷冻法和常规玻璃化冷冻法保存的卵巢组织、细胞，复苏率不高且方法繁琐4。本研究采用从小鼠卵巢分离的窦前卵泡为材料，探索建立适宜的窦前卵泡快速玻璃化冷冻保存技术，为卵泡保存和生殖工程提供技术基础。1 材料与方法1.1 动物来源出生 1014 d 的 ICR 雌鼠上海斯莱克实验动物有限责任公司，SCXK（沪）2003003 。1.2 仪器及试剂 Vitmaster 玻璃化快速冷冻仪（ URVD 000036，英国 IMT Ltd） ；MEM(32571 ，美国 Gibco 公司)；牛血清白蛋白（BSA，
8、A3311，美国 Sigma 公司） ；型胶原酶4（collagenase，265，美国 Gibco 公司） ；1 mg/mL 脱氧核糖核酸酶（DNase， 10104159001，瑞士 Roche 公司） ；HEPES（H6147 ，美国 Sigma 公司） ；乙二醇（EG ，E9129 ，美国Sigma 公司） ；海藻糖D （）Trehalose dihydrate，T0167，美国 Sigma 公司；聚乙烯吡咯烷酮（PVP，0507，美国 Amresco公司） ；台盼蓝干粉（Trypan，T6146，美国 Sigma 公司） ；含卵泡分离液的双腔培养皿（353037，美国 Falcon
9、公司） ；清洗皿：含体外操作液的 35 mm 培养平皿（353001，美国 Falcon 公司） 。1.3 方法1.3.1 溶液配制基础液：采用添加 4 mg/mL 牛血清白蛋白的 MEM 作为卵泡分离液、体外操作液、玻璃化冷冻液和复苏液的基础液；卵泡分离液：于基础液中添加 3 mg/mL 型胶原酶、1 mg/mL 脱氧核糖核酸酶；体外操作液：于基础液中添加 25 mmol/L HEPES；平衡液（equilibration medium，EM）7：于基础液中添加 4%乙二醇；玻璃化冷冻液（solid surface vitrification，SSV ）7 ：于基础液中添加 35%乙二醇 0
10、.4 mol/L 海藻糖、5% 聚乙烯吡咯烷酮；复苏液：包括、，分别为基础液中添加 0.3 mol/L、0.15 mol/L 海藻糖；台盼蓝染液（0.4%）：0.4 g 台盼蓝干粉溶于 100 5mL 生理盐水。1.3.2 分离窦前卵泡颈椎脱臼法处死小鼠，消毒腹部皮肤，打开腹腔，找到卵巢，取出双侧卵巢，放入 PBS 中清洗，转移 24 个卵巢至 0.5 mL 的卵泡分离液中，在体式显微镜下用尖镊撕碎并用滴管吹打后，放入 37 、体积分数为 0.05 的 CO2 培养箱中 3 min。每隔 3 min 取出培养皿，滴管吹吸，每次吹吸后都要观察是否有卵泡掉出，如有掉出，随即转移至清洗皿的基础液中清
11、洗 2 遍，操作时动作尽量精细，以维持卵泡基底膜完整。1.3.3 分组共进行 A、B 两个实验，每次实验对获得的卵泡分为 4 组，1 组作为新鲜对照组，其余 3 组采用不同的冷冻方法处理。1.3.3.1 实验 A采用常规玻璃化法、205 玻璃化法和液氮网篮法分别进行冷冻保存操作。分为 A1：新鲜卵泡对照组，将直接对卵泡进行台盼蓝染色，计数死、活细胞数，以计算卵泡的存活率；A2：常规玻6璃化组，卵泡转移至 50 L 的 EM 中 4 min；再转移卵泡至 SSV 中，连续转移 3 次（卵泡与 SSV 接触时间 2530 s） ；转移含卵泡的SSV 100 L 至冷冻管中，随即直接投入液氮罐保存；
12、A3：205 玻璃化组，卵泡转移至 50 L 的 EM 中 4 min；再转移卵泡至SSV 中，连续转移 3 次；转移含卵泡的 SSV 100 L 至冷冻管中，将冷冻管投入 Vitmaster 玻璃化快速冷冻仪（-205 ）装置中，继而转入液氮罐中保存；A4：液氮网篮组，卵泡转移至 50 L 的 EM中 4 min；再转移卵泡至 SSV 中，连续转移 3 次；将卵泡小液滴（共 100 L）滴到和液氮直接接触的网篮上（-196 ） ，小液滴立即形成透明的小冰珠；转移小冰珠至预冷的冷冻管中，密封后投入液氮罐保存。福建医科大学学报 2009 年 9 月 第 43 卷第 5 期常娟娟等：小鼠窦前卵泡的
13、玻璃化冷冻方法研究1.3.3.2 实验 B采用-205 玻璃化法、液氮网篮法和205 表面玻璃化法分别进行冷冻保存操作。分为 B1：新鲜卵泡对照组，操作方法同A1；B2：-205 玻璃化组，操作方法同 A3；B3：液氮网篮组，操作方法同 A4；B4 ：205 表面玻璃化组，卵泡转移至 50 L的 EM 中 4 min；再转移卵泡至 SSV 中，连续转移 3 次；转移含卵泡的 SSV 100L 至事先放置于快速冷冻仪（-205 ）装置中预冷的的冷冻管中（表面温度-205 ） ；冷冻管密封后投入液氮罐保存。71.3.4 卵泡复苏方法 两个实验的复苏方法相同。从液氮罐中取出冻存管，立即放入 37 水
14、浴锅，摇晃至冰珠完全融解（2 min） ；转移融解的冻存液至 1 滴 500 L 的复苏液（0.3 mol/L Trehalose）中 3 min；再转移至复苏液 （0.15 mol/L Trehalose）中 3 min；转移卵泡至 M2 中，清洗 12 遍后台盼蓝染色。1.3.5 台盼蓝染色新鲜卵泡或冷冻复苏后的卵泡与 0.4%的台盼蓝染液等体积混合，510 min 内观察卵泡的染色情况，并分别计数被染成蓝色（死卵泡） 、未染成蓝色（活卵泡）的卵泡数；分别按下式计算存活率和复苏率：存活率=活卵泡数/（死卵泡数+活卵泡数） 100%复苏率= （冷冻复苏后卵泡存活率/ 新鲜卵泡存活率）100%
15、1.4 统计学处理8采用 SPSS 11.5 软件处理数据。 单因素方法分析（one way ANOVA）比较组内复苏率，各组均数以最小显著差法（ least significant difference,LSD） 、SNK、Duncan 进行两两比较和显著性检验。2 结 果2.1 形态学观察倒置显微镜下可见，分离出的窦前卵泡大部分呈圆形或卵圆型，有完整的颗粒细胞层，色泽明亮，层次分明，颗粒细胞层周围光滑；颗粒细胞层数较少的卵泡及卵母细胞清晰可见，位于卵泡的中间或略偏一侧，镜下表现为圆而明亮，胞质均匀；颗粒细胞层数较多的卵泡在镜下看不清卵母细胞，其颗粒细胞密而紧凑，紧紧包围着卵母细胞，其外围与
16、膜紧密相连，外观光洁明亮均质。少量卵泡表现为基底膜模糊或破损，卵泡细胞松散或游离到卵泡外，卵母细胞逸出卵泡，变形或崩解。冷冻前后卵泡在形态上无明显差别。2.2 台盼蓝染色结果活卵泡未被染色，死卵泡被染成蓝色（图 1） 。92.3 不同方法复苏率比较不同方法冷冻复苏小鼠窦前卵泡的复苏率见表 1。A,B 实验中，液氮网篮和205 玻璃化冷冻的冷冻效果一致，两种方法的卵泡复苏率差别无统计学意义；常规玻璃化的冷冻效果最差，205 表面玻璃化冷冻的冷冻效果最好。表 1 不同冷冻方法对小鼠卵泡复苏率的比较（略）3 讨 论在辅助生殖医疗实践中，以往常用程序化慢速冷冻法来冻存胚胎或生殖细胞。但该法需昂贵的高精密程序降温仪、操作复杂繁琐（全程约需 2.53 h） 、耗液氮量多，并且无法
