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1、1天然的人源性核糖体展示抗体库的构建与初步鉴定【摘要】 目的 构建库容量大、多样性好的核糖体展示单链抗体(ScFv)库,为进一步筛选 ScFv 奠定基础。 方法 从健康自愿者的外周血淋巴细胞提取 mRNA,经 RTPCR分别扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)DNA,进而连接形成 ScFv DNA。将其连接TVector转化 E.coli JM109 大肠埃希菌,经蓝白筛选,挑取 9 个阳性克隆测序以鉴定 ScFv 组装。通过体外转录和翻译对抗体文库进行初步鉴定。 结果 VH、VL 和 ScFv DNA 分别约为 350、650 和1 100 bp。本试验成功构建 ScFv 核糖体展
2、示模板。 结论 成功构建天然的大容量核糖体展示人源性 ScFv 文库,为下一步利用亲和富集筛选技术获得各类 ScFv 奠定基础。 【关键词】 抗体; 单克隆; 核糖体; 埃希氏菌属; 基因文库单链抗体(SingleChain fragment variant,ScFv)是通过基因工程技术方法把重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)连接而构建的重组蛋白,较之完整抗体具有分子量小、通透性高等特点,更适合用于药物靶向和免疫生物治疗。构建 ScFv 可通过传统的杂交瘤技术或噬菌体展示技术制备,而近年来问世的核糖体展示技术(ribosomal display,RD)是一种不受细胞转染和表达等因素影响的完
3、全细胞外展示系统工程1,简化了 ScFv 的筛选过程,可望筛选到高亲和力2的 ScFv。本研究选用健康自愿者的外周血淋巴细胞为材料,构建天然大容量核糖体展示 ScFv 文库, 为下一步筛选各类 ScFv 奠定基础。1 材料与方法1.1 材料和试剂 mRNA 提取试剂盒(瑞典 Amersham 公司) ;Taq DNA 聚合酶,T4 DNA 连接酶,兔网织红细胞裂解液,T7 RNA 聚合酶,rNTPs RNase inhibitor(美国 Promega 公司) ;pMD18 TVector载体(日本 Takara 公司) ;RNA 抽提试剂盒(瑞士 Roche 公司) ;脂多糖(LPS,美国
4、SigmaAldrich集团公司) 。1.2 方法1.2.1 mRNA 提取和 RTPCR 抽取 10 位健康志愿者外周血,其中男性 5 例,女性 5 例,用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。按mRNA 提取试剂盒 (Amersham)说明书所述步骤提取 mRNA。以Oligo(dT)为引物逆转录合成第一链 cDNA,具体方法按说明书进行。1.2.2 ScFv DNA 的构建及扩增 利用 mRNA 反转录合成 cDNA第 1 链,以第 1 链为模板,扩增抗体基因按文献扩增人类主要的轻重3链可变区基因,所有引物序列根据抗体两端相对保守的框架区设计23。所需引物和寡核甘酸均由上海生工负责合成。扩增重链
5、VH 可变区引物为:VH/T7(上游): 5GCAGCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCACCATGAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG3VH2(下游): 5TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC3其中划线部分为 T7 启动子序列;黑体部分所示为核糖体结合位点。扩增 VL 可变区引物为:VL(上游):5ATTGAGCTCACCCAGTCTCCA3Ck(下游):5GAACACTCATTCCTGTTGGAGCT3引物中的简并碱基符号 M=A/C,R=A/G,S=C/G,W=A/T,按程序 1(30 个循环:94 1 min55 2 min72
6、2 min)进行PCR,分别扩增 VH 和 VL cDNA ,对扩增产物进行纯化并测定其浓4度。Linker 序列为(Gly4Ser)3,该引物两端的各 18 个碱基分别与VH 和 VL 基因的 3端和 5端相互补。将 VH、VL 和 Linker 等量混合后,经程序 2(7 个循环: 94 1 min63 4 min)进行聚合反应使 VH 和 VL 籍 linker DNA 连接形成 ScFv DNA。然后通过引物 VH2 和 CK 进行 PCR 扩增,执行程序 1,使聚合的 ScFv DNA 得到扩增。1.2.3 核糖体展示抗体库的构建 将最后纯化的核糖体 ScFv 展示模板连接 TVec
7、tor,用 Bio Rad 电转化仪将连接产物转化入 E.coli JM109,通过蓝白筛选 ,随机挑取 9 个克隆子,进行菌落 PCR 法验证。将验证阳性的克隆子测序,分析序列,以此评价文库序列的多样性。1.2.4 核糖体展示抗体库的初步鉴定 将 PCR 扩增的随机 ScFv DNA 文库进行离体转录(终浓度/100 L:1转录 Bufffer、10 mmol/L DTT、100 U RNase inhibitor、0.75 mmol/L rNTPs、40 U T7 RNA 聚合酶、2 g随机 DNA 文库) ,37 反应2 h,回收 mRNA。转录产物再用兔网织红细胞裂解液系统进行离体翻译
8、(50 L的体积加入兔网织红细胞裂解液 35 L、1 mmol/L不含亮氨酸的氨基酸复合物 0.5 L、1 mmol/L 不含甲硫氨酸的氨基酸复合物 0.5 L、40U RNase 抑制剂 1.0 L、mRNA 2 g)30 培育 30 min,于冰上放置。5将体外翻译完成的产物立即从 30 拿出,加入冰冷的 PBSMB溶液,轻轻混匀后,加入已用 LPS 封闭好预冷的酶联板中,每孔 50 L,冰上放置 12 h。用 PBSTM(1PBST 缓冲液中含 5 mmol/L MgCl2)冲洗 3 遍,每次 5 min,然后用 PBSM(1PBS缓冲液中含 5 mmol/L MgCl2)冲洗 2 遍,
9、每次 5 min。加入 EB缓冲液(1PBS 缓冲液中含 20 mmol/L EDTA),冰上放置 10 min,吸取上清。重复此步骤 1 次。将收集的上清用 RNA 抽提试剂盒(Roche)提取上清中的 RNA,引物 VH/T7 和 Ck 反转录扩增RNA 得到一轮筛选后的 ScFv DNA 文库。将 DNA 文库又进行体外转录、翻译、筛选,重复 2 次。得到 3 次筛选后的 ScFv DNA 文库。分别以回收的 RNA 为模板进行 RTPCR。2 结 果2.1 VH、VL 及 ScFv DNA 的扩增结果 扩增得到的 VH 和 VL DNA 分别约为 350 bp 和 650 bp,VH、
10、 VL 和 linker 连接后的ScFv 片段大小为 1.1 kb 左右。将大量扩增的 ScFv DNA 通过琼脂糖凝胶电泳回收纯化,保存于-20 (图 1) 。2.2 核糖体展示 ScFv 文库的构建及分析 将菌落 PCR 验证为阳性的 9 个克隆子测序。结果表明,克隆的 9 条 ScFv 序列都是完整的,为开放阅读框,内部没有终止密码子。通过 VBASE DNAplot 6软件分析 9 条 ScFv 序列,其重链分别属于VH1,VH3,VH5 ,VH4 基因家簇,轻链分别属于VK,VK,VK亚基因家簇。根据 Kabat 软件分析,9 条序列的重链和轻链 CDRs(互补决定区)也均有不同程
11、度的变化。2.3 核糖体展示 ScFv 文库的初步鉴定 将每轮回收得到的 RNA各取 2 L进行 RTPCR扩增,扩增结果见图 2。从图中可以看出,第一轮筛选后回收的 mRNA 进行 RTPCR扩增,得到一条非常微弱的条带。而经过 3 轮筛选后,得到非常明亮的扩增条带。3 讨 论RD 是蛋白质筛选的重要工具,已用于筛选配体、受体,确定抗原表位,开发新的蛋白酶抑制物和新的药物等。该技术的特点是:正确折叠的完全蛋白和编码它的 mRNA,同时结合在核糖体上,利用抗原抗体特异性结合的特点,便于蛋白富集,便于抗体文库筛选,是一种无细胞系统的蛋白质改造技术,可分为真核和原核 RD。真核系统较原核系统有一定
12、的优越性,原核系统受内源 RNase 的影响较大,生成的 mRNA 容易降解,而真核系统受内源 RNase 的影响较小。另外真核系统有利于提高某些蛋白质的翻译和折叠效率4。因此在本研究中笔者采用真核 RD。核糖体展示完全在体外进行,弥补了噬菌体展示、细菌表面展示、酵母表面展示)等细胞内展示的7不足,显著增强了库容量及分子多样性,库容量可以达到10131015,比噬菌体展示文库( 约 109)提高了 104106 倍5。有研究表明合理的 ScFv 应有一个连接 VH 和 VL 的柔性序列,通常是(Gly4Ser)3,而且 VH 和 VL 两功能域的排序应是 VH 在上游,VL 在下游。否则,Sc
13、Fv 不仅活性极差,而且难于诱导免疫应答6。鉴于此,笔者所构建的 ScFv 也按上述顺序排列。互补决定区(CDRs)在抗原抗体特异性结合方面起着重要作用,CDRs 的多样化意味着不同抗原特异性多样化。从实验结果可以看出,所构建的 ScFv DNA文库序列是完整而多样的,可用于进一步进行特异性抗原的筛选。在本实验中,以 LPS 作为抗原进行了三联复合体的筛选。经过 3 轮筛选后扩增得到的 DNA 条带明显比只经过一轮筛选后扩增的 DNA条带强,说明在 RD 过程中,能与 LPS 特异性抗原相结合的 ScFv基因得到了显著的富集。表明构建的核糖体展示文库是成功的,为进一步的 ScFv 筛选奠定了坚
14、实的基础。【参考文献】1 Christian Z,Patrick A, Andreas P. Ribosome display selecting and evolving proteins in vitro that specifically bind to a targetJ. Nature Methods, 2007(4):269279.2 黄开红,李学先,陈茵婷,等. 大容量核糖体展示抗体库的构8建与初步鉴定J.中国实用内科杂志 , 2007,27(18):14651469.3 吴红艳,章晓联,潘 勤. 利用核糖体展示文库初步筛选与伤寒杆菌型纤毛结合的细胞受体J. 生物技术通讯 , 2
15、004,15(4):319322.4 Levin A M, Weiss G A. Optimizing the affinity and specificity of proteins with molecular displayJ. Mol Biosyst, 2006(2):4957.5 Smith G P, Petrenko V A. Phage displayJ. Chem Rev, 1997, 97(2):391410.6 朱 毅,朱 进,冯振卿, 等. 日本血吸虫单克隆抗抗独特型抗体NP48 单特异性双链抗体的构建表达与初步鉴定J. 中国血吸虫病防治杂志, 2005,17(4):241245.