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1、1大鼠骨髓源性肝干细胞肝内移植后定居状况作者：赵继学 王广义 张海玉【摘要 】 目的 探索大鼠骨髓源性肝干细胞同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居情况。方法 采用全骨髓培养法体外培养细胞，贴壁筛选纯化骨髓间充质干细胞并进行体外培养、扩增，应用肝细胞生长因子(HGF)诱导分化出肝干细胞，鉴定后，经肝脏中叶注射入同种异体正常组和暴发性肝衰竭组大鼠体内,于移植后的第1、2 、4 周取受体肝脏移植原位（注射部位)、邻位（距注射部位0.5 cm)组织，应用 PCR 技术检测性别决定因子基因片段，研究肝干细胞在大鼠肝脏内定居情况。结果 经肝脏注射移植的肝干细胞在正常组和肝损伤组的肝脏内均能定居,且定居的细
2、胞数量上肝损伤组明显多于正常组。结论 经肝脏注射移植的骨髓源性肝干细胞可以定居于肝脏内，且定于肝脏的干细胞数量与肝脏是否损伤密切相关。 【关键词】 骨髓间充质干细胞；肝干细胞；细胞移植骨髓间充质干细胞(MSCs) 具有多向分化潜能，可以在体外诱导分化出肝干细胞，此种骨髓源性肝干细胞可以为肝组织移植工程提供新的细胞来源。近年来的研究主要集中于体外诱导 MSCs 为肝干细胞，此种细胞具备了肝细胞的形态，在体外能够表现出一定的2肝细胞功能1 ，但对骨髓源性肝干细胞在体内的定居和定位能力情况尚不明确。本实验通过对大鼠 MSCs 进行体外培养，诱导、分化出肝干细胞，同时建立暴发性大鼠肝衰竭模型，探讨骨髓
3、源性肝干细胞同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居情况。1 材料与方法1.1 材料低糖 DMEM 培养基(Invitrogen)、Percoll(Pharmacia,比重1.077 g/L)(Gibco 公司)、胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶2(Sigma)、肝细胞生长因子（HGF)(CYTOALAB 公司)、细胞培养箱(Forma 公司) ；纯系 SD 大鼠、3 周龄、体重 100120 g(供体大鼠)和成年纯系 SD 雌性大鼠、体重 180220 g(受体大鼠)，由吉林大学实验动物中心提供。1.2 骨髓源性肝干细胞培养1.2.1 MSCs 分离、培养及定向肝干细胞的诱导分化从供体 SD 大
4、鼠股骨提取骨髓细胞。用比重 1.073 的 Percoll分离液行 MSCs 分离,加含抗生素及 10%小牛血清的 IMDM 培养和3扩增，取第 3 代 MSCs 加入 HGF(20 g/L)诱导定向肝干细胞分化。1.2.2 诱导后的骨髓源性肝干细胞鉴定用 ELASA 法检测细胞培养液中的甲胎蛋白（AFP)、白蛋白（ALB) 。用免疫组化法检测细胞中细胞角化蛋白（CK)18、CK19和波形蛋白（Vimentin)的表达。1.3 肝损伤动物模型的制作和分组受体雌性 SD 大鼠 20 只，随机分为正常大鼠组和肝损伤组。肝损伤组用质量浓度 10%D氨基半乳糖溶液一次腹腔内注射，剂量 1 200 mg
5、/kg 体重。1.4 同种异体大鼠骨髓源性肝干细胞移植正常组大鼠和肝损伤组大鼠，分别以戊巴比妥麻醉，仰卧位固定，常规消毒、备皮、铺无菌巾，上腹正中切口，长约 1 cm，于肝中叶以 BD胰岛素注射器注射肝干细胞悬液 0.4 ml（107/ml )，观察无出血后缝合伤口。41.5 受体体内移植骨髓源性肝干细胞鉴定应用 PCR 技术检测性别决定因子基因片段(sex determining region of the Y，Sry)。干细胞移植后 1,2，4 w 后取受体肝脏移植原位(注射部位 )、邻位 (距注射部位 0.5 cm)组织，应用 PCR 技术检测2性别决定因子基因片段 (Sry)。引物按文
6、献3设计，由上海 Casarry 生物有限公司合成序列，外引物对 SRY1/ SRY2 扩增片段大小为 317 bp，内引物对 SRY3/SRY4 扩增片段大小为121 bp。2 结 果2.1 骨髓源性肝干细胞的培养结果 大鼠 MSCs 经原代培养，细胞传代，诱导分化，细胞异形性较诱导前增加，表现为圆形、椭圆形细胞数量较诱导前明显增加，而梭形细胞数量减少，诱导培养10 d 左右，细胞形态表现为圆形、椭圆形细胞为主，梭形细胞已极少见。免疫组化染色，二氨基联苯胺（DAB)显色，在倒置显微镜下，可见细胞形状显圆形或卵圆形，胞浆内出现棕黄色颗粒。CK18、CK19、Vimentin 呈阳性表达。细胞培
7、养液中 AFP、ALB含量诱导前分别为(0.0210.008) ng/ml 和(0.720.14) g/L；诱导后分别为(0.4030.042) ng/ml，(6.10.32) g/L。诱导后的AFP、ALB 含量明显高于诱导前（P0.05)。表明经诱导的 MSCs5分化为肝干细胞。见图 1。2.2 肝损伤模型病理结果D氨基半乳糖注射后，大鼠肝脏肝索紊乱，肝细胞肿胀变性、灶性及大片坏死，伴出血及炎性细胞浸润。见图 2。2.3 性别决定因子基因片段检测结果肝损伤组：检测 1 w 时阴性，2 w 时原位肝组织 Sry 阳性表达，邻位未表达，而 4 w 时原位及邻位组织检测到 Sry 表达，原位表达
8、较 2 w 时增强，邻位较弱。正常肝脏组： 1 及 2 w 均未检测到表达，4 w 时检测到原位微弱表达。见图 3。3 讨 论MSCs 具有多向分化潜能，特别是具有向肝脏干细胞、肝细胞及血管内皮细胞分化的潜能4 ，因而有望成为肝组织移植工程新的种子细胞来源。由于 MSCs 是成体干细胞，取材方便，可以来自患者自身，无排斥反应，故具有重要的临床应用价值。本实验根据文献报道5 ，使用 HGF，使 MSCs 分化为肝干细胞，对骨髓源性肝干细胞同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居情况进行初步研究。6目前研究表明移植肝干细胞可存活于受体许多部位包括肝、脾、腹腔、胰腺、肺、肠系膜、肾及肾脂肪囊、腹膜后等部
9、位2，68 。肝脏由于其独特的营养环境、生理及解剖结构环境无疑是最理想的场所，可经门静脉输入或肝实质植入，该组实验采用肝脏植入方法，取得较好效果，说明此方法是安全可行的。本实验采用同种异体移植，应该考虑免疫排斥反应，但文献报道，纯化的MSCs 具有独特的免疫原性，进行同种异体移植不需要预先应用免疫抑制剂，无免疫排斥反应，是良好的基因治疗靶细胞。目前鉴定受体体内被移植后的肝干细胞有许多方法，其中较为常用的是以雄性动物为肝干细胞供体1 ，雌性动物接受细胞移植后，分化增殖的细胞 Y 染色体阳性，证明雌性受体内存活的细胞来自雄性供体细胞，这就可以清楚地将植入的细胞与原有的细胞区分开来,进一步研究移植作
10、用，本实验采用雄性供体细胞为雌性受体移植，检测移植部位细胞的 Y 染色体表达情况，进而检测移植细胞是否定植。实验结果显示，移植后 2 w 肝衰竭大鼠移植原位检测到表达，4 w 表达明显增强，而且临近部位出现表达；正常大鼠在移植后 4 w移植原位出现微弱表达。实验证实，骨髓源性肝干细胞在正常大鼠肝脏及肝损伤大鼠肝脏内均能定居，但在肝损伤大鼠肝脏内定居能7力明显增强。考虑可能为大鼠肝损伤后，刺激机体分泌出各种促进肝细胞再生的生长因子，为移植细胞提供定居所需的微环境。文献报道，在正常大鼠体内，HGF 等因子的活性是被抑制的，只有在肝损伤时，启动肝再生程序，这些因子才能被激活，引起肝细胞有丝分裂。本文
11、通过实验证实了大鼠骨髓源性肝干细胞移植后可以定居于受体肝脏内，而且在肝损伤后有利于干细胞移植的定居，这为下一步研究定居于肝内的骨髓源性肝干细胞的功能奠定了基础。【参考文献】1 李秉璐，曲 强，赵玉沛，等. 人骨髓基质干细胞向肝细胞分化过程中白蛋白的表达研究J.中华外科杂志，2005；43（11) ：7135.2 高英堂，马梦兰，刘 敏.人类 Sry 基因用于产前诊断的初步研究J.中华妇产科杂志，1997；32（11) ：6524.3 Tashiro H，Fukuda Y，Kimura A,et al.Assessment of microchimerism in rat liver trans
12、plantation by polymerase chain reactionJ.Hepatology，1996；23 （4):82834.84 Schwartz RE,Reyes M,Koodie L,et al.Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocytelike cellsJ.J Clin Invest,2002；109（10):1291302.5 张刚庆，方驰华，池达智. 肝细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究J.中华外科杂志，2
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