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1、1大鼠骨髓基质干细胞在与成骨细胞共育环境下的成骨特性【摘要】 目的 在与成骨细胞(OB)共培养的条件下，观察大鼠骨髓基质干细胞(MSCs)的成骨特性。方法 取自 3 月龄大鼠骨髓分离MSCs，扩增后以免疫组化法鉴定其表型，OB 取自 1 日龄乳鼠，酶消化法获得。传代后的 MSCs 消化后分为 MSCs/OB 共培养组与普通培养组，观察 MSCs 的形态学变化及矿化能力，20 d 后半定量RTPCR 方法检测两组骨钙素的表达，茜素红染色后显微镜下计数钙化结节。结果 共培养组的 MSCs 形成的钙化结节数高于普通培养组(P0.01);共培养组的 MSCs，其细胞内骨钙素表达量明显高于普通培养组(P
2、0.05)。结论 与 OB 共培养的 MSCs 成骨能力增强。 【关键词】 骨髓基质干细胞;成骨细胞;共培养老年性骨质疏松是一种退行性病变，其病理基础是由破骨细胞引起的“骨吸收”大于成骨细胞(OB)引起的“ 骨形成” 。OB 来源于多潜能骨髓基质干细胞(MSCs)，既往研究倾向于研究 MSCs 向 OB 分化，以及分化过程中的影响条件，对于 OB 对 MSCs 分化的影响的研究较少，因此，本研究设计并建立了 MSCs/OB 共培养模型，并观察 OB 对 MSCs 分化的影响。21 材料与方法1.1 材料 3 月龄 SPF 级 SD 大鼠 6 只(购自广州中医药大学动物实验中心，动物合格证号：0
3、025183)，1 日龄以内清洁级 SD乳鼠 10 只(购自中山大学动物实验中心，动物合格证号：0023787)。双层细胞培养板，普通细胞培养板(Corning)，DMEM(Gibco)，胎牛血清 (杭州四季青)，淋巴细胞分离液(1.072 g/ml, 天津 TBD 公司)，乙二胺四乙酸(EDTA)、胰蛋白酶，Rna 酶(Sigma) 。Trizol 试剂盒(R&D)。GAPDH 正链：5GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA3，反链：5AGGCACCCAGGGTGATGCAA3;骨钙素正链：5GCCCTCTCCAAGACATATA3，反链：5CCATGATCACGTCGATATCC3。1.
4、2 方法1.2.1 OB 的分离、扩增及鉴定 取 10 只 1 日龄乳鼠颅盖骨,去除软组织,用 PBS 缓冲液多次漂洗,快速剪碎 ,用 11 的 0.25%胰蛋白酶和 0.1%胶原酶于 37消化 10 min。以 1 200 r/min，离心5 min,弃上清液,用含 20%小牛血清培养液悬浮细胞并接种于培养瓶中, 于 37恒温、5%CO2 及饱和湿度的细胞孵箱中培养。将骨组织3块再用 11 的 0.25%胰蛋白酶和 0.1%胶原酶于 37 消化 20 min,离心收集细胞,并接种于培养瓶中, 以上步骤重复 2 次。每 23 d 更换培养液, 待原代细胞长至 80%瓶底面积时以 0.25%胰蛋
5、白酶(含0.02%EDTA)消化, 1 瓶分 24 瓶的比例传代培养，进行扩增。倒置显微镜观察细胞形态，碱性磷酸酶(ALP)染色观察细胞分泌情况及矿化结节染色。1.2.2 MSCs 的分离、扩增及鉴定 大鼠处死后用 75%乙醇浸泡 10 min。取股骨和胫骨，剔去肌肉组织后用 PBS 冲洗 3 次，剪开骨头两端，露出骨髓腔。用 DMEM 培养液冲洗骨髓腔，反复 2次。冲洗后的液体过 200 目不锈钢网筛后，按 11 的体积比加于淋巴细胞分离液上层以 1 200 r/min 离心 20 min，吸取液面交界处的单个核细胞。PBS 悬浮细胞，以 200 r/min 离心 6 min，反复 2次。吸
6、去上清液后用 DMEM 培养液悬浮细胞并调整细胞浓度为1105/cm。接种细胞于塑料培养瓶，每瓶加细胞悬液 5 ml。接种72 h 后换液 ,此后每 34 d 换液 1 次。待原代细胞长至 80%瓶底面积时传代培养, 以 0.25%胰蛋白酶(含 0.02%EDTA)消化, 1 瓶分24 瓶的比例传代培养, 反复进行扩增。倒置显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测CD44、CD34 及 CD45。41.3 共培养模型的建立与分组 利用复合培养体系将 OB 和MSCs 培养在培养液以及其中的大分子蛋白可以相互交流而细胞间不相互接触的培养板内，其间的隔膜孔径为 0.4 m。培养上室内接种 OB，培养下室
7、内放置经处理的盖玻片并接种 MSCs。分共培养组、普通培养组 2 组，每组于同一培养板重复 12 孔。1.4 效应指标的检测 培养第 20 天时，各组均取 6 孔 MSCs消化后进行裂解，测定骨钙素 RNA 浓度，取 2 g 总 RNA 进行反转录，反应体系含 0.5 g/l Oligo dT 2 l，10 mmol/L dNTP 1.5 l，40 U/l Rnasin 1 l，200 U/l MMLV RT 酶 1 l，及buffer 共 25 l,37反应 60 min。取 2.5 l cDNA 作为模板于 25 l 反应体系中进行 PCR。PCR 条件：94预变性 5 min;变性：94
8、，40 s，退火：58.6 35 s，延伸： 72 ，45 s，32 循环;72 7 min 后终止反应，4冷却。产物取 10 l 于 1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化已锭染色，利用凝胶成像系统(BioRad Gel Doc 2000)进行光密度扫描，比较目的基因平均光密度值(A 值)。余 6 孔进行茜素红染色并计数钙化结节。1.5 统计学处理 采用 SPSS11.5 软件进行 t 检验。2 结 果2.1 MSCs 的形态学观察 原代初贴壁的 MSCs 呈成纤维细胞5外观，贴壁细胞逐渐呈现集落生长，原代培养 45 d，贴壁细胞开始增殖并向三角形、多角形、梭形等分化，表面颗粒少。68 d 后，部分区
9、域形成细胞团簇，细胞呈现成纤维细胞梭形外观，有较多突起，胞核明显，呈卵圆形，可见 13 个核仁，胞质丰富、清晰。生长期细胞分裂相多见，细胞突起互相联接。原代培养细胞密度为1105/ml 时，1012 d 长满瓶底。融合成片的细胞排列有一定的方向性，呈旋涡状排列，细胞呈梭形或椭圆形等。传代细胞搁置24 h 迅速贴壁，伸展，细胞呈均匀生长，细胞形态更加单一，56 d 铺满瓶底 (图 1)。图 1 原代 MSCs 形态学观察(40)2.2 MSCs 表面抗原鉴定 免疫组化检测结果显示细胞均一性较好,2 代细胞均一性在 90%以上,CD34、CD45 表达为阴性, CD44表达阳性。2.3 OB 的形
10、态学观察 原代细胞培养 1 d 后细胞贴壁展开，呈多角形，不规则，胞核大而清楚，呈圆形或卵圆形，含 12 个核仁。培养 57 d 时细胞半汇合， 78 d 时细胞 80%汇合，12 d细胞重叠生长，15 d 细胞结节形成，基质堆积，原代培养细胞连续培养至 20 d 时出现不透光的钙化结节。生长期细胞分裂相多见，细胞突起相互连接。汇合时呈铺路石状。2.4 茜素红染色及 Gomoris 法行骨 ALP 染色结果 茜素红染6色矿化结节呈现酒红色，ALP 染色可见胞质内出现黑色颗粒或块状沉淀。2.5 效应指标检测结果 普通培养组骨钙素含量及钙化结节计数分别为 0.7590.064;6.604.14,共
11、培养组分别为0.9500.017;29.6011.34。表明共培养组骨钙素表达量钙化结节计数显著高于普通培养组(P0.05 ，P0.01)。3 讨 论OB 来源于多潜能 MSCs，OB 功能活性的改变除了与 OB 数量、OB 本身存活期有关外，前 OB 数量与功能活性也起到重要作用。MSCs 具有干细胞的共性，即具有自我复制和多向分化能力，在不同条件下可以分别分化为所有中胚层来源的组织，如 OB、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞等13 ，目前已经成为最具优势的组织工程种子细胞。OB/MSCs 共培养体系是建立在特殊的基础上，使两种不同类型的细胞共同生长在同一培养环境中，
12、彼此不相接触，但细胞所分泌的物质可以通过培养板的微孔膜相互渗透，从而影响对方的生物学功能。单独的 MSCs 本身成骨能力并不强，本实验证实了这一点，因而在其向成骨分化过程中，多需要加入成骨诱导剂，如地塞7米松、 甘油磷酸钠、维生素 C 等。骨钙素是近年新发现的一种蛋白质4 ，它由成骨细胞合成。它是 OB 基因转录和表达的产物，也是骨形成指标之一，在正常的骨形成过程里，OB 首先表达型骨胶原，以构成骨基质的主要成分，然后开始表达骨 ALP，为矿化做准备，矿化开始后表达骨钙素，骨钙素的合成受维生素 D 调控。可见骨钙素是由 OB 合成分泌的一种非胶原蛋白，特异性表示成骨活性，为骨形成的敏感指标，是
13、反映骨转换率的特异性指标。共培养体系细胞裂解液中骨钙素表达明显高于单独培养组，这说明经过共育后 MSCs 向成骨分化增强。本结果显示表明 OB 对 MSCs 增殖以及向成骨分化有较强的诱导作用。根据相关文献研究5 9 ，作者推断，共培养体系中钙化结节数增多，与 OB 分泌骨形态发生蛋白(BMP)有关。OB 可合成、贮存并释放 BMP，目前认为成骨细胞 BMP 的含量可反映 OB的骨形成能力，BMP 可以诱导血管周围 MSCs 分化为成骨或成软骨细胞，并进一步形成骨和软骨。内源性 BMP 为一组分子量不同的复合物，其生物效应比克隆纯化的单一 BMP 作用强，它们可以刺激局部的生骨前体细胞增殖、分
14、化，并通过自分泌和旁分泌作用，形成正反馈机制，调节细胞的活动，加速骨形成。综上所述，OB 对 MSCs 分化存在着促进作用，其细胞信号8通路可能与 BMP 及其受体有关，而其具体作用机制有待于进一步研究。【参考文献】1 Wang Y, Volloch V, Pindrus MA,et al.Murine osteoblasts regulate mesenchymal stem cells via WNT and cadherin pathways: mechanism depends on cellcell contact modeJ.Tissue Eng Regen Med,2007;1(
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