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1、1大鼠酒精性肝损伤中 PPAR mRNA 表达与氧化应激的关系【摘要】 目的 观察大鼠酒精性肝损伤肝组织中过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR) mRNA 表达变化与氧化应激的关系，探讨 PPAR 在酒精性肝损伤中的作用。方法 将 60 只 Wistar 大鼠随机分为 5 组：对照组 1 组、观察组 4 组（包括 4、8、12、 16 w 组） 。采用白酒灌胃法复制酒精性肝损伤动物模型，分别于开始造模后的第 4、8、12、16 周时处死各组动物，检测肝组织中PPAR mRNA 的表达、血清游离脂肪酸(FFA)水平、肝组织中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力，并分析 PPAR
2、mRNA 的表达与 FFA 水平、MDA 含量、SOD 活力之间的相关性。结果 与对照组比较，各观察组大鼠 PPAR 的表达受抑制；随造模时间延长，其表达水平呈进行性降低，特别是在 12、16 w 时更为明显（P0.01） ；血清 FFA 水平、肝组织中 MDA 含量明显增加，随造模时间延长更为明显（P0.01,P0.05） ；肝组织中 SOD 活力明显下降，随造模时间延长更为明显（P0.01） 。且 PPAR mRNA 表达与血清 FFA 水平、肝组织中 MDA 含量之间呈负相关(P 0.05)，与肝组织中 SOD 活力呈正相关(P0.05)。结论 PPAR 表达与氧化应激关系密切，在酒精性
3、肝损伤进程中具有重要作用。 2【关键词】 过氧化物酶体增殖物激活受体 mRNA；氧化应激；酒精性肝损伤过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）是一类由配体激活的核转录因子，活化后可以调控多种核内靶基因的表达，具有多种生物学效应1 。研究发现，作为 PPARs 亚型之一， PPAR 具有调节脂肪代谢、炎症反应、免疫功能、细胞分化等作用，与诸多肝脏疾病的发生、发展关系密切。笔者已研究证实，PPAR 表达与核因子(NF)B 、肿瘤坏死因子(TNF) 、白介素(IL)6 等多种炎性细胞因子关系密切，在酒精性肝损伤炎症反应中具有重要作用2 。本实验将从 PPAR mRNA 表达与氧化应激的关系入手，进一
4、步探讨 PPAR mRNA 的表达在酒精性肝损伤发病机制中的作用。1 材料与方法1.1 实验动物分组 健康 Wistar 大鼠 60 只，雌雄各半，随机分为 5 组：对照组 1 组，观察组 4 组，每组 12 只。根据造模时间的不同，观察组分为 4、 8、12、16 w 组。实验期间各组大鼠均予以饮用水及全价营养颗粒饲料喂养。1.2 动物模型建立 大鼠经适应性喂养 1 w 后，观察组参照相关文献造模3：用红星牌二锅头白酒（北京酿酒总厂生产，约为310.2 mmol/L 酒精溶液） ，以 1.5 ml/100 g 体重每日灌胃 1 次，分别连续灌胃 4、8、12、16 w。对照组以等量 0.9%
5、氯化钠溶液，每日灌胃 1 次。1.3 实验标本制备 分别于造模 4、8、12 、16 w 末，禁食 12 h，水合氯醛麻醉动物，下腔静脉采血，分离血清，用于检测血清游离脂肪酸（FFA）水平；同时，快速取部分新鲜肝组织在 4下制成肝组织匀浆，经高速离心后取上清，用于检测肝组织中丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活力；并取一部分肝组织经液氮速冻保存，用于 RTPCR 方法检测 PPAR mRNA 的表达。1.4 实验方法 采用比色法测定血清 FFA 水平；制备肝组织匀浆，分别测定肝组织中 MDA 含量和 SOD 活力。以上均严格按照试剂盒（南京建成生物工程公司提供）操作说明操作。按照总
6、 RNA 提取试剂盒（美国 BBI 公司产品）操作说明提取总RNA，经变性琼脂糖电泳法检测其完整性，以随机引物（由沈阳联星生物技术有限公司设计合成并纯化，见表 1）逆转录合成cDNA，分别以适量 cDNA 为模板进行 PCR 扩增反应。 表 1 目的基因引物序列及反应条件4反应参数：95预变性 2 min，然后 95变性 30 s，59 退火30 s， 72延伸 1 min，共 30 个循环，反应结束前 72加时延伸5 min。PCR 产物在 2%琼脂糖凝胶上 80 V 恒压电泳 2 h，经凝胶成像系统分析成像，以 actin 为内参照，目的基因 PPAR 与actin 的条带光密度比值（IO
7、D）作为 PPAR mRNA 的相对量进行比较分析。1.5 统计学处理 采用 SPSS11.5 统计软件包，计量资料采用组间t 检验（方差不齐时用 t检验） ，等级资料用秩和检验，计数资料用 2 检验。2 结 果实验过程中，观察组大鼠因灌胃误入气管或胃穿孔（经解剖证实）共死亡 10 只，其中 4、12 w 组各死亡 2 只，8 、16 w 组各死亡 3只，对照组无大鼠死亡，各组之间无显著性差异（P0.05） ，具有可比性。2.1 血清 FFA 水平变化 随造模时间延长，观察组大鼠血清 FFA水平逐渐增加，造模 8 w 后开始更为明显，与对照组比较差异有统计学意义（P0.01） ；组间比较差异亦
8、有统计学意义（P 0.01，P 0.05） 。见表 2。表 2 各组大鼠血清 FFA 水平变化5与对照组比较：1）P0.05，2）P0.01；与 4 w 组比较：3）P 0.05，4）P 0.01；与 8 w 组比较：5）P0.05，6）P 0.01；与 12 w 组比较：7 ）P0.05，8）P0.01；下表同2.2 肝组织中 MDA、SOD 变化 见表 3。 随造模时间延长，观察组大鼠肝组织中 MDA 含量逐渐增加，造模 8 w 后开始更为明显，与对照组比较差异有统计学意义(P0.01，P0.05)；组间比较差异亦有统计学意义（P0.01，P0.05） 。随造模时间延长，观察组大鼠肝组织中
9、 SOD 活力逐渐下降，与对照组比较差异有统计学意义(P0.01，P0.05)；组间比较差异亦有统计学意义（P 0.01，P 0.05） 。表 3 各组大鼠肝组织中 MDA 含量及 SOD活力2.3 RTPCR 结果 琼脂糖凝胶电泳在 646 bp、353 bp 处显示出 PPAR、action 阳性电泳带（图 1） 。M：DNA Marker；A：对照组；B：4 w 组；C:8 w 组；D:12 w 组；E:16 w 组图 1 肝组织中 PPAR 的基因表达从表 4 可以看出，随造模时间延长，观察组大鼠肝组织中PPAR 的基因表达逐渐降低，造模 12 w 后开始更为明显，与对6照组比较差异有
10、统计学意义(P0.01) ；组间比较差异亦有统计学意义（P0.01，P 0.05） 。2.4 相关性分析 见表 5。相关性分析表明，在酒精性肝损伤的不同时间段 PPAR 的基因表达与肝组织中 MDA 含量、血清 FFA 水平之间均存在良好的效应关系，呈负相关（P0.01，P0.05） ；而 PPAR 的基因表达与肝组织中 SOD 活力呈正相关（P0.05） 。表 4 各组大鼠肝组织中 PPAR mRNA 的表达表 5 PPAR 的表达与氧化/抗氧化指标相关性分析3 讨 论酒精性肝损伤致病因素单一(即长期大量的酒精摄入)，但其确切的发病机制却较为复杂，目前尚未完全明确。近年来，氧化应激在酒精性肝
11、损伤中的重要作用已得到普遍公认。自由基引起的氧化应激反应是诱发肝损伤的重要原因4 。作为氧化应激的主要分解产物，FFA 具有很强的细胞毒性，破坏细胞膜、线粒体和溶酶体膜等引起细胞内微器官损伤，而且还能明显加强细胞因子的毒性，导致肝实质变性、炎性细胞浸润和纤维化等改变5 ；而 MDA 与蛋白质结合形成的加合物，可以激活机体的免疫反应而导致肝损害6 。作为体内重要的抗氧化酶， SOD 能清除7超氧阴离子自由基，减少脂质过氧化反应，使机体细胞和组织免受损伤，对机体的氧化和抗氧化平衡起着重要作用，是体内重要的保护细胞因子。酒精及其代谢产物可激活 O2 产生大量自由基，促发并加重氧化应激，减弱机体抗过氧
12、化能力，氧化应激产物增加，使肝脏在酒精第一次打击的基础上遭受第二次打击，促使酒精性肝损伤的发生及发展。本实验发现，在酒精性肝损伤的不同时间段，血清 FFA 水平、肝组织中 MDA 含量随造模时间延长逐渐增高，肝组织中 SOD 活力逐渐下降；而 PPAR mRNA 表达受抑制，随造模时间延长逐渐明显，且与血清 FFA 水平、肝组织中 MDA 含量之间呈负相关，与肝组织中 SOD 活力呈正相关。提示，酒精可促发并加重氧化应激，降低机体清除自由基及抗过氧化能力，体内过氧化产物增多，从而促进酒精性肝损伤的发生与发展；而 PPAR mRNA 与氧化应激关系密切，在酒精性肝损伤进程中具有重要意义。笔者分析
13、认为其可能的作用机制如下：酒精及其代谢产物在损伤肝细胞（第一次打击）的同时抑制了 PPAR 的表达，促发并加重氧化应激，降低SOD 活力，使机体清除自由基及抗过氧化能力减弱，FFA 、MDA等有毒代谢产物增加，对肝细胞形成第二次打击，促进酒精性肝损伤的发生、发展。PPAR 表达与炎症反应、氧化应激关系密切，在酒精性肝损伤8进程中具有重要作用，至于其确切作用机制及途径，以及上调PPAR 表达是否对酒精性肝损伤具有拮抗作用，还有待进一步研究探讨。【参考文献】1 Grimaldi PA.The roles of PPARs in adipocyte differentiationJ. Prog Li
14、pid Res，2001；40(4)：26981.2 孙 龙，迟宝荣，杨世忠，等.过氧化物酶体增殖物激活受体在实验性大鼠酒精性肝损伤中的表达J.中华消化杂志，2007；27(4)：2745.3 李舒丹，厉有名，虞朝辉 .大鼠慢性酒精性肝损伤观察J.中国公共卫生，2004；20(2)：1956.4 李有田, 薛 浩,许 丹，等. 自拟解酒护肝饮治疗酒精性肝病 32例J.吉林大学学报(医学版) ，2004；30(6)：9679.5 阎 明，孟繁立，董春峡，等.非诺贝特和辛伐他汀对酒精性脂肪肝血清游离脂肪酸谱的影响J.中国药理学通报，2003；19(11)：12904.96 赵冬梅，刘耕陶. 肝细胞损伤机制进展的研究及其对研究治肝病新药的启示J.中国药理学通报，2001；17(6)：6059.
