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1、1大鼠脑发育过程中神经型一氧化氮合酶的表达变化【摘要】 目的 用免疫组化方法探讨神经型一氧化氮合酶在大鼠脑发育过程中的表达变化。方法 分别随机选取E12、E15、E18、P0 、P5 及 P10 期的 SD 大鼠，应用免疫组化方法，检测大脑皮层、纹状体及海马 nNOS 阳性细胞的密度。结果 E12、E15 及 E18 期大鼠脑组织未见 nNOS 阳性细胞；大脑皮层及纹状体区 P0、P5 及 P10 期均可见 nNOS 阳性细胞。nNOS 阳性细胞密度，在 P0、P5 及 P10 期逐渐降低，两两比较，有显著性差异(P0.05)。结论 胚胎期大鼠脑内 nNOS 染色呈阴性反应；生后大脑皮层及纹状
2、体 nNOS 阳性细胞密度逐渐减小，海马 nNOS 阳性细胞密度则有所增加。 【关键词】 神经型一氧化氮合酶(nNOS) 免疫组化 脑发育 大鼠ABSTRACT: Objective To observe the expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) during the growth of brain in rats with immunohistochemical method. Methods Fetal and newborn rats were randomly selected, and divided into 6
3、 groups according to developmental stages of E12, E15, 2E18, P0, P5 and P10. The sections were stained by nNOS immunohistochemical staining. The density of nNOS immunoreactive cells was collected and measured by image gathering and analysis software in the sections of cerebral cortex, striatum and h
4、ippocampus. Results nNOS immunoreactive cells were not found at telencephalon in fetal rats. In newborn rats, the density of nNOS immunoreactive cells was the highest at P0 in the cerebral cortex and striatum, and reduced sequentially at P5 and P10. In the hippocampus, the number of nNOS immunoreati
5、ve cells at P5 and P10 was obviously larger than that at P0. There was no significant difference between P5 and P10. Conclusion nNOS immunohistochemical staining is negative at telencephalon in fetal rats.With the development of the cortex and striatum, the expression of nNOS declines in newborn rat
6、s. However, it increases in the hippocampus during the growth.KEY WORDS: neuronal nitric oxide synthase (nNOS); immunohistochemistry; brain development; rat在神经系统中，一氧化氮(nitric oxide, NO)不仅在神经细胞间起着神经递质的作用，而且是中枢神经系统的信使物质，可能与3脑细胞的发育、脑细胞的学习和记忆过程及脑缺血时调整脑血供应等有关。近年来，与 NO 合成相关的一氧化氮合酶 (NOS)越来越受到研究人员的重视。目前，在生物
7、组织中已经确定的 NOS 有三种亚型，即神经型 NOS(neuronal NOS, nNOS)、内皮型NOS(endothelial NOS, eNOS)和有病理意义的诱导型NOS(inducible NOS, iNOS)。其中脑中的 nNOS 主要是一种可溶性的胞质酶，分子量为 150-160ku，主要在神经元中表达。本实验应用免疫组化技术，研究 nNOS 在大鼠大脑皮层、纹状体及海马发育过程中表达的变化，为进一步探讨其在中枢神经系统发育过程中的作用提供理论依据。1 材料与方法1.1 试剂 兔抗 nNOS 多克隆抗体，购自北京中杉金桥生物科技有限公司，SABC 即用型试剂盒购自武汉博士德生物
8、有限公司，DAB 显色剂购自美国 sigma 公司。1.2 实验动物 随机选用体重 250-300g 的 SD 大鼠雌、雄各数只，于晚 8:00 以后雌雄合笼，保证同一笼中只有一只雄鼠，若干雌鼠。于次日早 8:00 以前，雌雄分笼，并观察雌鼠阴道口。若存在阴栓，为配种成功的标志。未配种成功的雌鼠继续于当晚与雄鼠合笼，并继续观察，直至配种成功。41.3 组织取材 胚鼠：将孕 12、15 、18d 的雌鼠，按350mg/kg 体重腹腔注射 100g/L 水合氯醛，动物麻醉成功后，开腹，寻找子宫，并迅速各取下 3 只胚胎，置于 0.01mol/L 的 PBS溶液(pH 7.4)中，快速取脑，置于包氏
9、液在 4 冰箱中固定。新生鼠：分别于生后 24h 以内 (P0)、生后 5d(P5)及生后 10d(P10)随机各选取 3 只，迅速断头取脑，置于包氏液 4 冰箱中固定。1.4 冰冻切片制备 包氏液中充分固定的脑组织，置于700mL/L 酒精中充分洗脱，后置 300g/L 蔗糖溶液中 4沉降，待组织沉底后，OCT 包埋，入-26 恒冷箱切片机，隔 3 取 1 制成20m 厚冠状切片， -30保存备用。1.5 组织染色1.5.1 尼氏染色 将制备好的冰冻切片吹干后，入焦油紫中孵育 10min，常规水洗，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。1.5.2 免疫组化染色 将冰冻切片吹干后，在 30mL/
10、L H2O2溶液(甲醇配 )中室温孵育 15min；3mL/L Triton X100 溶液中室温孵育 30min；50g/L BSA 室温孵育 20min，甩去不洗；滴加1100 兔抗 nNOS 多克隆抗体， 4 过夜；次日滴加生物素化的羊5抗兔 IgG，37孵育 2h；滴加 SABC，37 孵育 30min。以上各步骤之间用 0.01mol/L 的 PBS 溶液(pH7.4)彻底漂洗。最后 DAB显色，10min 左右终止显色；酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。1.5.3 空白对照实验 用 PBS 替代一抗孵育切片，结果为阴性。1.6 图像分析与统计方法 ImagePro Plus
11、图像分析软件，测定大脑皮层、纹状体及海马单位面积 nNOS 阳性细胞的密度。采用 SPSS10.0 软件，数据进行正态检验符合正态分布，并运用方差分析进行统计学处理，以均数标准差(s)表示，检验水准=0.05。2 结果2.1 尼氏染色结果 可见大量形态完整的神经细胞，排列紧密，胞质着蓝色，证明组织切片制备成功。2.2 免疫组化染色结果 nNOS 阳性染色呈棕黄色，阳性反应物分布于胞质和突起，胞核不着色，有的细胞可见较长串珠样突起。胚胎期 12d(E12)、15d(E15)及 18d(E18)各组大鼠脑组织切片未见6nNOS 阳性细胞。在新生大鼠神经系统中的大脑皮质、纹状体及海马等区域中有 nN
12、OS 阳性细胞广泛分布，主要是无棘突细胞，在这些区域呈散在分布。应用图像分析软件，计算阳性染色细胞密度(个/m2)。2.2.1 大脑皮层 新生大鼠大脑皮层 P0、P5 及 P10 期均可见散在的 nNOS 阳性细胞(图 1)。这些阳性细胞散在分布于大脑皮层的-层，为椎体形、梭形和圆形，有的细胞可见较长的棕色突起，为神经细胞伸出的树突或轴突。P0 期 nNOS 阳性细胞密度最高，P5 和 P10 期逐渐降低，两两之间差异有统计学意义(P0.05 ，表1)。图 1 新生大鼠大脑皮层 P0、P5 和 P10 期 nNOS 的免疫组化染色结果（略）Fig.1 nNOS immunohistochemi
13、cal staining in the cerebral cortex of newborn rats at P0, P5 and P10 by turnsnNOS immunoreactive cell was brown. the density of nNOS immunoreactive cell was the highest at P0(A) in the cerebral cortex, and reduced sequentially at P5(B) and P10(C). Scale bar: 100m72.2.2 纹状体 大鼠纹状体 P0、 P5 及 P10 期均可见大量
14、NOS 阳性细胞( 图 2)。阳性细胞为圆形、三角形和梭形，胞质丰富、深染，有的细胞可见伸出的棕色树突或轴突。nNOS 阳性细胞密度P0、P5、P10 期依次降低，两两之间差异有统计学意义(P0.05，表 1、图 3)。图 2 新生大鼠纹状体 P0、P5 和 P10 期 nNOS 的免疫组化染色结果（略）Fig.2 nNOS immunohistochemical staining in the striatum of newborn rats at P0, P5 and P10 by turnsnNOS immunoreactive cell was brown. the density o
15、f nNOS immunoreactive cell was the highest at P0(A) in the striatum, and reduced sequentially at P5(B) and P10(C). Scale 8bar: 100m表 1 新生大鼠大脑皮层及纹状体 NOS 阳性细胞密度（略）Table 1 The density of nNOS immunoreactive cells in the cerebral cortex, striatum and hippocampus of newborn rats (s, piece/m2, n=3)*P0.05, comparison between each other; *P0.01, comparison between each other图 3 新生大鼠海马 P0、P5 和 P10 期 nNOS 免疫组化染色结果（略）Fig.3 AC are results of nNOS immunohistochemic
