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1、1大鼠脊髓腰节段神经元存活信号转导通路及凋亡调控因子的增龄变化作者：李雅莉 赵宁 张丽 李林【摘要 】 目的 观察大鼠脊髓腰节段神经元存活信号转导通路中重要因子和调控凋亡相关因子的增龄变化及与老化的关系。方法 按月龄将雄性 SD 大鼠分为 1、3、6 、12 、18 、24 月龄 6 组。应用免疫组织化学染色和 Western 印迹法观察增龄大鼠脊髓腰节段神经元存活信号转导通路中的转导因子 PI3K、 pp70S6K、磷酯化环腺苷酸应答元件结合蛋白(pCREB) 及凋亡调控因子 Bax 和 Bcl2 的表达情况。结果 大鼠脊髓腰节段神经元 pp70S6K 和 pCREB 随增龄变化明显，1 月
2、龄时表达量较低， 3 月龄时有所增高，至 6 月龄、12 月龄达高峰，24 月龄时明显减低；而 PI3K 的变化不大。大鼠脊髓腰节段 Bax 表达随年龄增高逐渐增加，至 24 月龄表达量达高峰；Bcl2 表达随年龄增加而逐渐降低，至 24 月龄时降至最低点。与 6 月龄（青年期）大鼠相比， 24 月龄（老年期）大鼠脊髓腰节段神经元 pp70S6K、pCREB 和 Bcl2 表达明显降低，Bax 表达显著增高。结论 老年大鼠脊髓腰节段 pp70S6K、pCREB 和Bcl2 的表达明显降低， Bax 表达显著增多，提示脊髓老化与神经元存活信号转导通路和凋亡调控因子的变化有关。 2【关键词】 脊髓
3、；老化；神经元存活信号转导通路；细胞凋亡【Abstract】 Objective To investigate the changes in neuronal survival signal transduction pathway and apoptosis regulating factors in the lumbar spinal cord of ageincreasing rats, and to evaluate their correlation with aging. Methods Male SD rats were divided into 1, 3, 6, 12, 18
4、and 24monthold groups according to their age. The expressions of important factors in neuronal survival signal transduction pathway (PI3K, pp70S6K, pCREB) and apoptosis regulating factors (Bax, Bcl2) in the lumbar spinal cord of rats were measured by immunohistochemistry and Western blot. Results Th
5、e expressions of pp70S6K and pCREB in the lumbar spinal cord was lower in 1monthold rats, increased at the age of 3 months, reached the peak in 6 and 12monthold rats, and decreased to the lowest level at the age of 24 months; but PI3K did not show significant changes. The expression of BAX was incre
6、ased with age increasing, and reached the peak at the age of 24 months. The content of Bcl2 was reduced with ageing, and dropped to the bottom in 24monthold rats. Compared with those in young rats (6 month old), the expressions of pp70S6K, 3pCREB and Bcl2 were decreased and the content of Bax was in
7、creased significantly in the lumbar spinal cord of aged rats (24 month old). Conclusions Aged rats show a decrease in the expressions of pp70S6K, pCREB and Bcl2, and an increase in the content of Bax in the spinal cord, suggesting that aging of spinal cord is related to the changes in survival signa
8、l transduction pathway and apoptosis regulating factors.【Key words】 Spinal cord; Aging; Signal transduction; Apoptosis目前对于增龄的研究多见于海马、心肌、学习记忆13等，与脊髓老化的相关研究甚少。神经营养因子的后信号转导通路、磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K) /蛋白激酶 B (PKB 或 Akt)及其下游激酶磷酸化 P70 核小体 S6 激酶(pp70S6K) 信号转导通路是调节细胞增殖、分化和凋亡的重要信号转导通路，也是神经细胞存活的重要信号转导通路4 。通过上调神经元存活信号
9、转导通路中的重要因子可以干扰凋亡级联反应和促进神经元生存，从而阻止因衰老导致的细胞凋亡。本研究观察了 6 个不同年龄段大鼠的脊髓腰节段神经元存活信号转导通路中重要因子 PI3K、pp70S6K 和磷酸化 cAMP反应元件结合蛋白（pCREB ）的增龄变化，以及细胞凋亡调控因子 Bax 和 Bcl2 表达的变化，以探讨脊髓老化的可能机制，并评价4增龄对信号转导通路和凋亡相关因子的影响。1 材料与方法1.1 实验动物Sprague Dawley (SD)大鼠，雄性，购自北京大学医学部实验动物科学部，动物分级为无特定病原体 (specific pathogen free，SPF) 级，合格证号：SC
10、XK(京 20020001)。1.2 试剂 PI3K 抗体、pp70S6K 抗体、pCREB 抗体、Bax 抗体、Bcl2 抗体、actin 抗体、封闭用正常羊血清原液、抗体稀释液、生物素标记的兔抗山羊 IgG、辣根过氧化物酶 (HRP)标记链亲合素、DAB 显色试剂盒，均购自中杉金桥生物技术公司；Tris 碱、丙烯酰胺、N,N 亚甲双丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基磺酸钠（SDS） 、DTT、过硫酸胺、溴酚兰、EDTA、苯甲基磺酰氟、亮抑制肽、牛血清白蛋白（BSA） ，均购自美国 Sigma 公司；TEMED、二甲基甲酰胺、预染标准分子量蛋白质，购自美国 Gibco BRL 公司；浓缩显影液、浓缩
11、定影液购自乐凯公司。51.3 主要仪器620E 型冷冻切片机（英国 Shandon 公司） ；CHK213 型光学显微镜、BX51 型生物显微镜（日本 Olympus 公司） ；Imagepro Plus 4.0 图像分析系统（美国） ；PowerPac200 型稳压稳流电泳仪、PowerPac200 型湿转电泳仪(美国 BioRad 公司)。1.4 实验方法1.4.1 动物分组大鼠按不同月龄分为 6 组：1 月龄、 3、6、12、18 和 24 月龄，每组 3 只置于 SPF 环境即屏障系统中饲养。1.4.2 免疫组织化学染色检测大鼠灌杀后完整取出脊髓腰节段，连续冠状面切片，厚度 40 m。
12、每只大鼠各取位置相同的 3 张脊髓片，用 3% H2O2 室温孵育 10 min；磷酸盐缓冲液（ PBS）洗 5 min，洗 3 次；10%羊血清室温封闭 30 min，PBS 洗 5 min，洗 3 次；分别加入不同的一抗（PI3K 抗体、pp70S6K 抗体、Bax 抗体）孵育，PBS 洗 5 min，6洗 3 次；加入生物素标记的兔二抗，室温孵育 2 h，PBS 洗 5 min，洗 3 次；加入 HRP 标记的三抗，孵育 1 h，PBS 洗 5 min，洗 3 次；DAB 工作液显色，显微镜下控制染色程度；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，置于显微镜下观察。阴性对照：分别以 PBS
13、T 和非免疫正常血清代替一抗进行免疫组化染色，其余步骤同前。1.4.3 Western 印迹检测参照 SturchlerPierrat 等的方法。取大鼠脊髓腰节段，称重，以 15 比例加入预冷的组织裂解液，匀浆制备样品，低温高速离心 12 000 r/min，取上清液。用 Folin 酚法测定蛋白浓度，调节各样品蛋白浓度统一为 5 g/L，加 2上样缓冲液， 100 沸水浴变性 5 min。分离胶为 15% SDSPAGE 凝胶，电泳缓冲液为 Tris甘氨酸，上样量 50 g/孔。恒压 60 V 电泳至溴酚兰到达分离胶后，加大电压至 120 V，溴酚兰到达分离胶底部时，结束电泳。冰浴中90 V
14、 转膜 120 min，将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜。5 脱脂奶粉封闭，4过夜。分别加入不同的一抗（PI3K 抗体、pCREB 抗体、 Bax 抗体、Bcl2 抗体、actin 抗体） ，室温 2 h；加入 HRP 标记的二抗，室温 1 h；ECL 法显示特异条带。用扫描仪将胶片的图像转入计算机中。使用 Image J 凝胶成像分析系统，对各个条带的整合灰度进行分析。将胶片上的 6 月龄组（青年组）7所对应条带的整合灰度值设定为 100，计算出其他各组对应条带的整合灰度值与 6 月龄组的相对百分比。1.5 统计学分析使用 SPSS11.5 软件进行单因素方差分析（Oneway ANOVA）
15、 ，数据以 xs 表示。2 结 果2.1 大鼠脊髓腰节段神经元存活信号转导通路中相关因子表达的增龄变化2.1.1 免疫组织化学法检测结果大鼠脊髓腰节段 PI3K 表达量在 1 月龄和 3 月龄时较低，从6 月龄时开始明显增高，12 月龄和 18 月龄时达高峰，24 月龄时略下降，但无统计学意义。pp70S6K 表达量开始随年龄增高逐渐增加，至 6 月龄（青年期）表达量达高峰，并维持至 12 月龄，在 18月龄时明显减少，至 24 月龄（老年期）时表达量最低。见表 1。表1 增龄大鼠脊髓腰节段 PI3K 和 pp70S6K 表达的变化（免疫组化染色）(略)82.1.2 Western 印迹法检测
16、结果大鼠脊髓腰节段 PI3K 表达量在 6 月龄和 12 月龄时最高，24月龄（老年期）时的表达量与 6 月龄（青年期）相比有所下降，但无统计学意义。大鼠脊髓腰节段 pCREB 表达量在 1 月龄和 3 月龄时较低，6 月龄达高峰，然后逐渐下降， 24 月龄时表达量最低。见图 1，表 2。表 2 增龄大鼠脊髓腰节段 PI3K 和 pCREB 的表达(略)2.2 大鼠脊髓腰节段细胞凋亡调控因子的增龄变化2.2.1 免疫组织化学法检测结果大鼠脊髓腰节段 Bax 表达量随年龄增高逐渐增加，至 24 月龄（老年期）表达量达高峰， 24 月龄与 6 月龄（青年期）相比表达量显著增，见表 3。表 3 增龄大鼠脊髓腰节段 Bax 及 Bcl2 表达的变化(略)2.2.2 Western 印迹法检测结果大鼠脊髓腰节段 Bax 表达的增龄变化趋势与免疫组织化学染色基本
