《大鼠肾脏缺血再灌注损伤过程中水通道蛋白2的表达变化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大鼠肾脏缺血再灌注损伤过程中水通道蛋白2的表达变化（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1大鼠肾脏缺血再灌注损伤过程中水通道蛋白2 的表达变化【摘要】 目的: 研究大鼠肾脏缺血再灌注损伤（IRI）后水通道蛋白2（AQP2 ）的表达变化与肾功能变化的关系。方法 : 建立大鼠左侧肾脏缺血再灌注损伤模型, 于 IRI 不同的时间点处死大鼠 , 留取尿液、 血清、 肾脏标本行尿常规、 肾功能、 肾脏病理形态学及AQP2 的免疫组化、 RTPCR 检测。结果: 大鼠肾脏 IRI 后出现尿量增多、 尿渗透压降低 , 血肌苷、 尿素氮升高症状; HE 染色示肾小管上皮细胞肿胀、 坏死、 脱落; AQP2 表达量及其 mRNA含量均较对照组减少, 这些变化于 IRI 3 d 时最低, 至 IRI
2、 7 d 时恢复正常。结论: 肾脏 IRI 后 AQP2 表达的减少可能是急性肾衰竭时尿量增多、 尿渗透压降低的重要因素之一。 【关键词】 肾缺血再灌注损伤 急性肾衰竭 水通道蛋白2缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury, IRI）, 是指发生缺血的组织器官, 当恢复血液灌注后缺血性损伤进一步加重的现象。肾脏作为高灌注器官, 非常容易发生 IRI, 临床上因为 IRI 而导致的急性肾功能衰竭（acute renal failure, ARF）的现象非常多见, 如 : 严重的烧伤、 大出血、 感染性休克等均会导致急性肾脏缺血, 当肾脏恢复血液灌注后都会因加重肾脏的
3、缺血损伤而引起2ARF1 。而在肾移植中 IRI 是造成移植肾原发失功、 移植失败及慢性排斥反应的主要原因之一2 。因此, 肾 IRI 时的病理生理变化一直是许多学者研究的重点。水通道蛋白（aquaporins, AQP）是20 世纪 90 年代新发现的一组细胞膜转运蛋白, 普遍存在于动、 植物及微生物中, 自从它被发现以来, 国内外学者对它们进行了大量的研究3, 4 。目前在哺乳动物已鉴定出 13 种水通道蛋白5, 其中分布于肾脏的有 AQP1、 AQP2、 AQP3、 AQP4、 AQP6、 AQP7、 AQP86, 7 。已证明 AQP 在机体许多生理病理过程起着重要的作用, 但在肾 I
4、RI 过程中的变化尚不清楚。为此 , 我们通过将大鼠右侧肾脏摘除, 左侧肾蒂夹闭 40 min 后恢复血液灌注, 建立由 IRI 导致的 ARF 模型, 观察 AQP2 在肾脏的表达变化及与 ARF发展的关系, 以期从新的角度探讨 ARF 的发病机制, 并为疾病的防治提供理论基础。1 材料和方法1.1 材料 健康成年雌性 Wister 大鼠 (质量 25030 g), 80只, 由大连医科大学动物实验中心提供。实验动物随机分为 10 组: 对照和缺血再灌注 1、 2、 3、 5、 7 d 组; 每组 8 只。AQP2一抗体为兔抗鼠抗体购自武汉博士德公司; 免疫组化用 SP 试剂盒购自北京中杉金
5、桥公司; AQP2 及 actin RNA 引物由大连医科大学生化教研室马郁芳教授惠赠; 琼脂糖电泳 DNA 回收试剂盒、 3DRR019A mRTPCR 试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。1.2 方法1.2.1 肾缺血再灌注损伤模型的建立 所有实验动物均术前12 h 禁食, 自由进水。1.2.2 麻醉方法 实验大鼠应用 100 mL/L 水合氯醛 300 mg/kg 腹腔注射麻醉。1.2.3 实验组和对照组 参照 Kwon 等8 的方法建立肾缺血再灌注损伤模型。具体方法如下: 大鼠麻醉成功后腹部备皮, 取仰卧位, 应用 5 mL/L 碘伏溶液常规消毒铺无菌孔巾, 取腹部正中切口, 进入腹
6、腔后小心分离并结扎右侧肾蒂后摘除右肾; 游离左侧肾蒂, 用无损伤动脉夹夹闭左侧肾蒂, 阻断出入肾脏血流（在此过程中注意保持实验大鼠体温及减少腹腔的不显性失水）, 40 min 后重新恢复肾脏血液灌注。当松开动脉夹后肾脏在 2 5 min 内颜色由暗红转为鲜红表明缺血再灌注损伤模型建立成功, 肾血管无血栓形成, 关腹。若超过 5 min 肾脏颜色仍然未转为鲜红色则认为肾脏有血栓形成, 排除出实验组。对照组摘除右肾后, 仅游离左侧肾蒂而不进行夹闭, 40 min 后关腹。实验大鼠麻醉清醒后转入代谢笼内自由进水及进食。41.2.4 标本采集 分别于再灌注 1、 2、 3、 5、 7 d 后处死大鼠,
7、 留取标本。留取实验大鼠处死前 24 h 尿液标本, 计录尿量及进行尿渗透压检测。经腹主动脉取血 6 8 mL 静置 30 min 后 1 000 r/min, 离心 10 min, 留取血清以行血肌酐及尿素氮检测。取血后迅速摘除大鼠左侧肾脏, 予以用 PBS 液漂洗冲去血液后分别沿肾脏 冠状面和矢状面将肾脏切为 4 份, 一份予以用 100 mL/L 的甲醛 PBS 液固定以行病理学及免疫组织化学检测, 余下 3 份于液氮冷冻 1 h 后转入 -80冰箱保存以行 RTPCR 检测。每只大鼠相应检测标本取材部位保持一致。1.2.5 免疫组化和 RTPCR 实验方法 (1)免疫组化: 肾脏石蜡标
8、本切成厚度为 5 m 切片, 经二甲苯、 梯度酒精水化后按 SP试剂盒说明书操作步骤依次滴加一抗及二抗后 DAB 显色 12 min 。在(100) 倍光镜下每张切片肾小管集合管管腔内膜侧的细胞膜上呈清晰黄褐色颗粒为阳性表达, 随机选取互不重叠的视野 5 个, 在（400）倍视野下对阳性表达区进行量化处理。 （2）RTPCR 实验方法: 应用 TRIzol 试剂常规一步法提取肾组织标本总 RNA, 按DRR019A mRTPCR 试剂盒说明书以随机引物（AQP2 RNA 引物为上游 5CGAGCAGTGCTGGCTGAGTTC3, 下游5GCTCCTGCAGGCTCTTTGCCG3共 667
9、bp; actin RNA 引物为上游 5GATATCGCTGCGCTCGTCGTC3, 下游55CATGAGGTAGTCTGTCAGGTC3 560 bp, RNA 引物由大连宝生物试剂有限公司合成)。为模板逆转录合成 cDNA, 然后以cDNA 作为模板合成 DNA。以 actin 作为内源性 RNA 对照, 用actin 校正半定量, 凝胶图像分析系统测定各电泳带灰度值。1.2.6 统计学分析 采用 SPSS12.0 统计软件进行数据处理分析, 检测结果以 xs 表示, 两两比较采用 LSDt 检验。多组间比较采用方差分析。 P0.05）; 肾 IRI 组大鼠再灌注 1 d 起尿量较对照
10、组增多, 且尿量逐渐增多, 并于再灌注 3 d 尿量达到最多（ P0.01）; 以后尿量逐渐减少, 再灌注 7 d 恢复正常。 （2）尿渗透压检测: 各对照组间尿渗透压变化无统计学意义; 肾 IRI 组大鼠再灌注 1 d 起尿渗透压较对照组明显降低(P0.01); 再灌注 3 d 达到最低(P 0.01); 到再灌注 7 d 时尿渗透压恢复正常（表 1)。62.3 肾功能检测 各对照组间各项肾功能指标变化无统计学意义; 肾 IRI 组大鼠术后血肌酐和尿素氮较对照组明显升高, 再灌注 3 d 达到最高（P 0.01 ）, 以后逐渐减少, 于再灌注 7 d 恢复正常（表 1)。表 1 实验大鼠尿液
11、及肾功能变化（略）bP0.01 vs 对照组.2.4 肾脏病理学检测 通过对肾脏组织切片 HE 染色观察发现肾 IRI 组肾小管上皮细胞较对照组明显肿胀、 坏死、 脱落。这与国内外其他相关文献报道一致（图 1） 。2.5 AQP2 RTPCR 结果 RTPCR 电泳结果显示目的条带在 667 bp 处可见 AQP2 mRNA 表达。通过测定各条带光密度值, 计算目的条带与 actin 条带光密度值的比值表示 AQP2 mRNA 表达的相对强度。在各对照组间, AQP2 mRNA 表达量变化无统计学意义; 在 IRI 各时相组中, 再灌注 15 d AQP2 mRNA 表达量较对照组明显下降（0
12、.490.03 vs 0.910.03, P0.01）, 以再灌注 3 d 组 AQP2 mRNA 表达下降最明显（0.330.03 vs 0.910.03, P0.05） 。RTPCR 电泳产物结果(图 2)。图 1 大鼠肾脏的 HE 染色（400） （略）A: 对照组 ; B: 肾 IRI 组.图 2 AQP2 mRNA 变化（略）M: DNA marker; 1: 对照组; 2-6 : 分别为再灌注 1、 2、 3、 5、 7 d.2.6 AQP2 免疫组化染色结果 AQP2 在肾脏表达在肾集合管管腔上皮细胞的管腔膜侧和胞膜下的囊泡中, 免疫组化染色阳性结果表现为集合管主细胞管腔侧的棕黄
13、色染色。免疫组织化学染色结果以 IOD 值表示 AQP2 蛋白的累积光密度值。在各对照组间 , AQP2 表达量变化无统计学意义; 在对照组可见肾集合管 AQP2表达强阳性（图 3A）, 在 肾 IRI 各时相组中 , 再灌注 15 d AQP2 表达量较对照组明显下降 , 以再灌注 3 d 组变化最明显（794.9064.95 vs 3474.61150.01, P0.05, 图 3） 。8图 3 AQP2 免疫组化染色（400） （略）A: 对照组; B: 再灌注 1 d; C: 再灌注 2 d; D: 再灌注 3 d; E: 再灌注 5 d; F: 再灌注 7 d.3 讨论临床上 ARF
14、 有较高的致死率 9, 因此, ARF 时肾脏的病理生理变化, 一直是众多学者研究的重点。当肾脏发生缺血时, 缺血的肾组织氧供减少因而将进行无氧代谢, 进一步导致 ATP 生成减少10, 而近端肾小管和髓袢升支粗段主要利用 ATP 进行钠离子转运, 而集合管并不参与钠的重吸收, 主要是通过渗透梯度来进行水的重吸收, 故当肾发生局部缺血时, 传统观点认为损伤最明显的部位是肾近端肾小管和髓袢升支粗段而集合管在这一过程中变化应不明显11 。本实验通过用 RTPCR 及免疫组化方法检测肾 IRI 后AQP2 及其 mRNA 变化发现, ARF 时肾集合管 AQP2 的 mRNA含量和 AQP2 的表达
15、量较对照组明显减少, 由此可以推测, 肾集合管也受到明显损伤。本研究还显示, 大鼠肾脏 ARF 后随着 AQP2表达减少, 大鼠尿量增多, 尿渗透压降低; 随着 AQP2 表达量的恢复, 大鼠尿液变化也渐趋正常, 这表明 AQP2 在 ARF 这一病理生理过程中亦起着非常重要的作用, 而且 AQP2 表达的减少可能是导致 ARF 后尿液浓缩障碍的重要原因之一。本实验研究表明, 随着术9后 AQP2 表达量的降低和增加, 血肌苷、 尿素氮等肾功能指标出现恶化和好转, 具有一定的关联性, 故 AQP2 可能也是 ARF 时反应肾功能变化的重要指标。肾脏通过调节肾小球的滤过率和肾小管的重吸收率之间的变化来调节尿的排泄量。ARF 时, 由于肾小球滤过率的同肾小管重吸
