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1、1大鼠肾移植急性排斥模型中移植肾水通道蛋白2 mRNA 表达的变化作者：臧崇森 张纪周 傅耀文 张文岚 王金国 王伟刚【摘要 】 目的 研究水通道蛋白 2（AQP2）mRNA 在大鼠肾移植急性排斥模型中移植肾表达的变化及意义。方法 正常大鼠肾脏为正常对照组；Wistar 大鼠作为供、受者建立同系基因对照组；SD大鼠为供者、Wistar 大鼠为受者建立同种异体移植急性排斥组；SD大鼠为供者、Wistar 大鼠为受者，术后给予免疫抑制剂环孢素（CsA）建立同种异体移植免疫抑制组；均为雄性大鼠。 RTPCR半定量检测移植肾 AQP2 mRNA 在各组中表达的变化。结果 同种异体移植急性排斥组移植肾
2、AQP2 mRNA 表达下调，与正常对照组比较有统计学差异（P0.05） ，与同系基因对照组和同种异体移植免疫抑制组比较有统计学差异（P0.05） 。同系基因对照组和同种异体移植免疫抑制组中移植肾 AQP2 mRNA 表达的变化与正常对照组比较无统计学差异（P0.05） 。结论 AQP2 mRNA 的表达在急性排斥时表达下调，可以减少对水的重吸收，同时可以减少集合系统能量消耗，有利于移植肾功能的恢复。 【关键词】 大鼠； 肾移植； 急性排斥； 水通道蛋白2【Abstract】 Objective To study the change of aquaprorin2 (AQP2) mRNA in
3、 the graft of the rat renal transplantation model, especially after the acute rejection. Methods Normal Wistar rats renals were selected as control group, Wistar rats acting as both donors and receptors were selected as syngeneic control group, and SD rats acting as donors but Wistar rats acting as
4、receptors were selected as allogeneic acute rejection group given cyclosporine A (CsA) and allogeneic immunosuppression group (without given CsA). All rats were male. RTPCR method was applied to test the change of AQP2 mRNA expression of each group. Results The AQP2 mRNA expression in allogeneic acu
5、te rejection group was decreased significantly compared with that of other three groups (P0.05). Compared with control group, the AQP2 mRNA expression in both syngeneic control group and allogeneic immunosuppression group had no significant change (P0.05). Conclusions Downregulation of AQP2 mRNA may
6、 reduce reabsorption of water and energy consumption in collecting duct of renal transplant in acute rejection phase, which is beneficial to the recovery of renal transplant function.3【Key words】 Rat； Renal transplantation； Acute rejectuion； Aquaporin肾移植术后急性排斥反应（AR ）时会出现不同程度水钠平衡紊乱，而细胞代谢过程中需要的水主要通过对水
7、分子具有高度选择性的水通道蛋白(AQP)完成跨膜转运1 。在哺乳动物体内至少发现了 13 种 AQP，其中肾脏表达的 AQP 种类最多。AQP2 主要在肾脏的集合管表达，主要与尿液的重吸收功能有关2 。肾移植术后AR 时， AQP2 表达降低3 ，但其临床意义并不明确，国内迄今未见相关报道。本实验在建立大鼠肾移植 AR 模型的基础上研究 AR时移植肾 AQP2 mRNA 表达的变化，并分析其改变的临床意义。1 材料与方法1.1 材料与试剂 雄性 Wistar 大鼠体重 250300 g，由吉林大学基础动物实验室提供；雄性 SD 大鼠 200250 g，由北京维通利华实验动物有限公司提供。显微外
8、科手术器械(上海手术器械厂)，手术显微镜(苏州医疗器械总厂) ，常规手术器械若干，10%水合氯醛，肝素等渗盐水等。TaKaRa RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0 购于大连宝生物有限公司，PCR 特异引物由上海生工合成：AQP2 上游引物：5TGTGGGAACTCAGATCCATAG3 ，下游引物：5AGGCTCTGAGGAGAGTGGA3，扩增产物长度为 791 bp；4做为内参的 actin 上游引物：5AAGAGAGGCATCCTGACCCT3，下游引物：5TACATGGCTGGGGTGTTGAA3,扩增产物长度为 218 bp。1.2 方法1.2.1 手术及动物分组 利用
9、显微外科技术动脉端端吻合、静脉Cuff 套管吻合、输尿管端端吻合建立大鼠肾移植模型。正常雄性Wistar 大鼠肾脏为正常对照组（C 组） ；Wistar 大鼠作为供、受者建立同系基因对照组（W 组） ；SD 大鼠为供者，Wistar 大鼠为受者建立同种异体移植急性排斥组（S 组） ；SD 大鼠为供者、Wistar 大鼠为受者,术后给予环孢素（CsA）免疫抑制建立同种异体移植免疫抑制组（CsA 组） 。1.2.2 组织处理 术后 5 d 处死大鼠，切取移植肾，每组获得 8只移植肾。PBS 缓冲液漂洗冲去血液后，液氮中冻存。1.2.3 RTPCR 及产物鉴定 应用 Trizol 试剂常规提取肾组织
10、标本总 RNA，经紫外分光光度计定量后，取 0.5 g 总 RNA，按TaKaRa RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0 试剂盒说明书进行操作，扩增条件为：94变性 2 min,然后 94 30 s,60 30 s,72 60 s,共30 个循环，最后 72延伸 10 min。PCR 结束后取 20 l 产物在 1%琼5脂糖凝胶上进行恒压电泳，80 V,20 min；然后 0.5%溴化乙锭染色20 min。用 Kodak 凝胶电泳成像分析系统（EDAS）进行电泳结果的拍照及条带的强度分析，以 actin 作为内源性 RNA 参照，分别计算每一条泳道的 AQP2 与 actin 强度
11、比值。1.3 统计学方法 数据用 SPSS10.0 统计软件包进行单因素方差分析，实验组间差异比较采用 t 检验。2 结 果对照组、同系基因对照组、同种异体移植急性排斥组、同种异体移植免疫抑制组大鼠肾脏 AQP2 mRNA 的相对表达量分别为1.2810.046、1.4020.077、0.8100.022、1.3010.059。与对照组相比较，同种异体移植急性排斥组移植肾 AQP2 mRNA 表达显著下调（P0.05） ；与同系基因对照组和同种异体移植免疫抑制组相比较，其移植肾 AQP2 mRNA 表达显著下降（P0.05） 。同系基因对照组和同种异体移植免疫抑制组中移植肾 AQP2 mRNA
12、 表达的变化与对照组相比较无统计学差异（P0.05） ，见图 1。图 1 AQP2 RTPCR 扩增产物 1.0%琼脂糖凝胶电泳结果3 讨 论6肾移植术后 AR 时会出现不同程度的水钠潴留，与体内水钠平衡紊乱有关。目前认为水穿越细胞膜有两种方式：一是弥散通过脂质双分子层；二是通过细胞膜上的 AQP，其介导作用在水分子的跨膜转运中占主导作用。肾脏集合系统是尿液浓缩的关键部位，AQP2是集合管上皮细胞上最重要且受血管加压素（AVP）调节的 AQP，参与介导抗利尿激素（ADH）依赖的肾集合管通透性 4 。因此，AR 时移植肾 AQP2 的表达会发生相应的改变5 。本研究发现 AR 时 AQP2 mR
13、NA 的表达下调。为了排除此种下调可能与缺血 再灌注损伤及去神经损伤有关，本研究用近交系大鼠（Wistar 大鼠）建立了同系基因对照组。近交系大鼠具有个体之间在遗传上一致的特性，保持了遗传的稳定性和遗传基因的同源性，大鼠之间 MHC 完全相配。因此，近交系大鼠间肾移植不会发生AR。本研究中同系基因对照组仅有 2 只大鼠出现轻微的排斥，这与大鼠在繁育过程中有可能出现遗传的变异或污染有关。同系基因对照组移植肾 AQP2 mRNA 表达的变化与正常对照组相比较无统计学差异，说明 AQP2 mRNA 表达下调与缺血再灌注损伤及去神经损伤及其他的手术因素无关。为了进一步证实这种下调与 AR 的关系，本研
14、究建立了同种异体移植免疫抑制组。在此组中发现由于免疫抑制剂 CsA 的应用，组织形态学上可见的 AR 消失了，同时 AQP2 的下调也大大减轻或者完全消失，因此，本研究认为 AQP2 这种下调与肾移植术后 AR 有关。7Velic 等5认为集合管 ADH 依赖的调节水重吸收的主要靶点是 AQP2，它也属于醛固酮调节载体的家族。肾移植术后 AR 时AQP2 mRNA 表达下调，而且 CsA 治疗及同系基因移植后没有该变化。本研究与上述结果相同，同种异体移植急性排斥组移植肾AQP2 mRNA 表达下调，与正常对照组相比较有统计学差异；而同系基因对照组和同种异体移植免疫抑制组中移植肾 AQP2 mR
15、NA 表达的变化与正常对照组无统计学差异。AQP2 在尿液浓缩中起到重要的作用，AR 时 AQP2 表达下调，说明 AR 时集合系统的浓缩功能下降。但是，这会引起尿液重吸收的减少，对减轻 AR 时的水潴留有作用。Velic 等6认为在 AQP2 表达下调的同时集合管上皮细胞钠离子通道的表达也下调，这可能是节约能量的一种保护办法，以帮助应激的器官恢复和保护移植肾免受在集合系统可见的非免疫性和免疫性损伤，有利于移植肾功能的恢复。【参考文献】1 Nejsum LN.The renal plumbing system：aquaporin water channelsJ. Cell Mol Life S
16、ci，2005;62(15):1692706.2 Feraille E,Doucet A. Sodiumpotassiumadenosine triphosphatasedependent sodium transport in the kidney：hormonal controlJ.Physiol 8Rev，2001；81：345405.3 Edemir B,Reuter S,Borgulya R,et al.Acute rejection modulates gene expression in the collecting ductJ.J Am Soc Nephrol,2008;19(3):53846.4 Nielsen S，Frokiaer J,Marples D,et al.Aquaporins in the kidney：from mole
