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1、1大鼠肢体缺血再灌注早期血栓前状态的研究作者：杨敏，马平，徐文会，张宏江【摘要 】 目的 探讨大鼠急性下肢缺血再灌注早期血栓的形成情况。方法 将大鼠随机分为假手术组、下肢缺血再灌注组两组。夹闭大鼠股动脉并用张力带绑扎下肢，建立急性下肢缺血再灌注大鼠模型。观察急性下肢缺血再灌注大鼠血小板膜糖蛋白 GPb/a 和血管内皮细胞血栓调节蛋白(thrombomoclulin，TM)的表达。结果 缺血再灌注组大鼠血小板膜糖蛋白 GPb/a 表达高于假手术组(P 0.05)；缺血再灌注组大鼠血管内皮 TM 表达低于假手术组(P 0.05)。结论 急性下肢缺血再灌注可能导致大鼠血栓前状态的形成。 【关键词】
2、肢体缺血再灌注；血栓前状态；血小板膜糖蛋白；血栓调节蛋白Abstract：Objective To investigate the emerge condition of thromb in rats after ischemiareperfusion of limb.Methods The rats were randomly divided into 2 groups：sham operation group(N group)；the hind limb ischemia reperfusion group (IR group).An animal model of acute hind
3、2limb ischemiareperfusion was developed by clamping femoral artery and banding hind limb of rats.Changes in the expression of GPb/a of platelet membrane and TM of vascular endothelial cell in rats after ischemiareperfusion of limb were observed.Results The expression of GPb/a of platelet membrane in
4、 the IR group was significantly higher than that of the N group (P0.05).The expression of TM of vascular endothelial cell in the IR group was significantly lower than that of the N group (P0.05).Conclusion Acute hind limb ischemiareperfusion may induce the formation of prethrombotic state in rats.Ke
5、y words：limb ischemiareperfusion；prethrombotic state；platelet membrane lycoprotein；thrombomodulin缺血再灌注损伤是临床肢体血运重建后出现意外致残、致死的主要原因之一，是当今外科临床医生所常面对的具有挑战性的问题之一。创伤、断肢再植、术中使用止血带时间过长、腹主动脉瘤手术中钳夹血管及大血管栓塞再通等都可引起肢体缺血再灌注损伤。肢体缺血再灌注损伤是处于顿抑、休眠的肢体在血运重建之后的损伤导致的机体生理、生化改变和各器官的病理改变，这种损伤几乎影响到整个机体，进一步导致如心、肺、肾等远隔器官的损伤313
6、，甚至发生多器官功能障碍4 。尽管近来手术技术得以改善且围手术期管理水平有所提高，但死亡率和截肢率仍居高不下。如何认识再灌注损伤的预防和治疗，降低致残率和死亡率，将是我们长期所要研究的课题。缺血再灌注损伤的机制是多因素和错综复杂的，其中微血栓的形成可能起到重要作用。研究证实再灌注时血管内皮细胞和白细胞激活，内皮细胞释放多种黏附分子，激活的内皮细胞与白细胞相互作用，对微血管和细胞损伤产生影响。150 多年前，Virchow 就指出血管壁的损伤、血液流动的变化、血液性质的改变是形成血栓的三要素，而血栓前状态是很多因素引起的止血、凝血和抗凝系统失调的一种病理过程，具有易导致血栓形成的多种血液学变化，
7、是血栓形成的前期阶段。本试验通过黏附分子血小板膜糖蛋白 GPb/a和血管内皮细胞血栓调节蛋白(thrombomoclulin，TM)的测定，从血管内皮损伤、血小板活化、抗凝作用减弱三个方面对肢体缺血再灌注后血栓前状态进行研究。1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 实验动物 健康成年雄性 SD 大鼠，体重(20030)g，购于4山西医科大学实验动物中心。1.1.2 主要试剂及仪器 山羊抗大鼠 GPb/a 抗体，SANTA CRUZ 公司；抗大鼠 TM 抗体，LAB VISION 公司；FITC 标记兔抗山羊 IgG，北京中山金桥公司；SABC 免疫组化试剂盒，北京中山金桥公司；Olympus
8、 BX51 光学显微镜，日本；LeicaRM2015 切片机，德国莱卡公司；IDA2000 数码显微图象分析系统，中科院北京空海科技公司；Calibur 流式细胞仪，美国 BD 公司。1.2 实验方法1.2.1 实验分组 分为假手术组、缺血再灌注组两组，采用随机化原则，每组 8 只。1.2.2 动物模型制作 术前常规禁食 12 h，自由饮水。以 20乌拉坦(1 000 mg/kg)行腹腔内注射麻醉。将大鼠仰卧固定于操作台上，在后肢双侧股三角处剪毛，于腹股沟处沿血管走行纵行切开皮肤、皮下组织，钝性分离缝匠肌后部，游离股动脉、股静脉和股神经。在股动、静脉近端分别用动、静脉夹夹闭，并用张力带于股鞘下
9、绑扎肢体阻断侧支循环。右颈部开口分离颈内静脉，置管建立静脉输液系统，接微电脑静脉微量输液泵。2 h 后撤除血管夹，恢复动、静脉血流，3 h 后进行标本采集。51.2.3 实验动物的处理 假手术组与缺血再灌组相同的麻醉与手术操作，但未行血管夹闭及张力带绑扎；缺血再灌注组缺血 2 h，再灌注 3 h。1.2.4 标本制备和检测方法 检测 GPb/a 需取血，从心脏采血 0.5 mL(3.8枸橼酸钠 19 抗凝)，1 000 r/min 离心 5 min，取上清 5 uL 加入试管中；加入一抗 5 uL，避光孵育 20 min；加入荧光标记二抗 5 uL，避光孵育 20 min；加 1多聚甲醛 20
10、0 uL 固定 30 min；PBS 洗涤 4 min，用流式细胞仪检测，每管收集GPb/a 阳性细胞 20 000 个，记录 GPb/a 的阳性率。检测 TM 需取血管，取股动脉、股静脉，脱水、石蜡包埋，用免疫组化方法定性检测血管内皮细胞上 TM 的表达。步骤如下： a)切片常规脱蜡至水，二甲苯(20 min) 二甲苯 (20 min)100酒精(10 min)100酒精(10 min)95酒精(10 min)85酒精(10 min)70酒精(10 min)。b)3H2O2 室温孵育 510 min，以消除内源性过氧化物酶的作用。蒸馏水冲洗 2 min，冲洗 3 次。c)热修复抗原：将切片浸
11、入 0.001M 枸橼酸缓冲液(pH 6.0)，微波炉加热至沸腾后断电，间隔 8 min 后，重复 1 次，冷却 2 h，冷却后PBS 液(pH 7.4)洗涤 2 min，冲洗 2 次。 d)滴加 5BSA 封闭液，室温 20 min。甩去多余液体，不洗。 e)滴加稀释 150 的一抗(抗6大鼠 IgG)，4过夜。PBS 液冲洗 2 min，冲洗 3 次。f)滴加生物素标记的羊抗小鼠 IgG，室温 20 min，PBS 液冲洗 2 min，冲洗 3 次。g)滴加试剂 SABC 室温 20 min。PBS 液冲洗 5 min，冲洗 4 次。h)DAB 显色，自来水冲洗。i)苏木素轻度复染、梯度酒
12、精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。再用 BX51 型 Olympus 显微镜及IDA2000 数码显微图像分析系统进行图像分析，每组观察 30 个高倍视野(400) ，随机取 8 个视野，以平均光度为指标进行半定量分析。1.3 统计学分析 用 SPSS 11.5 统计软件，实验数据以(s)表示，组间均数比较采用 t 检验。检验水准取 0.05，P0.05 差异有显著性。2 结 果2.1 缺血再灌注组大鼠血小板膜糖蛋白 GPb/a 表达为(53.843.05)，高于假手术组(42.316.29)，二者比较具有统计学意义。2.2 缺血再灌注组大鼠血管内皮 TM 表达低于假手术组(P0.05)(见表
13、 1)表 1 急性肢体缺血再灌注大鼠血管内皮细胞 TM 的表达注：假手术组与缺血再灌组比较 P0.0573 讨 论早在 1944 年，Jesse 等5对止血带引发休克研究发现，止血带使用时间不超过 3 h，引发止血带休克可能性极小，相反止血带使用时间超过 3 h，则较易导致止血带休克，这种止血带休克不能通过静脉补充容量来预防。后来人们对动物骨骼肌缺血代谢变化进行研究发现，随着缺血开始，骨骼肌的无氧代谢开始，细胞内的三磷酸腺苷、磷酸肌酸进行性耗竭，缺血 3 h 三磷酸腺苷就完全水解，而在缺血后 1 h 磷酸肌酸就完全水解。在 28 下，如果止血带时间不超过 3 h，随着再灌注开始，细胞内三磷酸腺
14、苷在再灌注 2 h 后恢复正常水平，而磷酸肌酸则在再灌注后 1 h 恢复到正常水平。如果缺血超过 3 h，而缺血的肢体温度保持在 2，也不会导致细胞内三磷酸腺苷、磷酸肌酸的耗竭，从而避免了细胞损伤。这可能与低温下细胞能量代谢降低有关6 。Raymond 等7用无创性 P标记核磁共振分光镜观察细胞缺血再灌注时代谢改变得出，在肢体长时间的缺血中，如果每缺血 1 h 插入 10 min 再灌注，则可维持细胞内三磷酸腺苷正常水平，快速恢复细胞代谢，保护细胞不受伤害；而 Miller8 等则认为插入 5 min 就可以恢复细胞正常代谢。临床手术中，使用止血带的最大时限为 1.5 h，因此本实验选择室温下
15、缺血 2 h 再灌注 3 h 造模以更加接近于临床研究。近年来研究表明，肢体缺血再灌注可致微血管和细胞损伤。a)微8血管血液流变学改变：缺血再灌注早期可见中性粒细胞黏附在血管内皮细胞上，随后可有血小板沉积和红细胞缗线状聚集；再灌注期，激活的血管内皮细胞和中性粒细胞表面可表达黏附分子，增强细胞间的亲和力，使细胞在微血管内流速减慢，造成“滚动”现象；随着再灌注时间延长，中性粒细胞、血管内皮细胞表面的黏附分子表达进一步增加，中性细胞与内皮细胞发生黏附。黏附的中性粒细胞释放化学趋化物质，如白三烯、血栓素 A2 和血小板激活因子等，加重细胞间黏附和微血管堵塞。b)微血管口径的变化：损伤的内皮细胞肿胀、激
16、活的血管内皮细胞和中性粒细胞释放缩血管物质、扩血管物质合成与释放减少等作用共同导致微血管口径变小。c)微血管通透性增高：自由基损伤和中性粒细胞黏附是微血管通透性增高的的主要原因。150 多年前，Virchow 就指出血管壁的损伤、血液流动的变化、血液性质的改变是形成血栓的三要素，而血栓前状态是很多因素引起的止血、凝血和抗凝系统失调的一种病理过程，具有易导致血栓形成的多种血液学变化，是血栓形成的前期阶段9 。表现在：a)血管内皮细胞受损或受刺激；b)血小板和白细胞被激活或功能亢进；c)凝血蛋白(凝血因子 )含量增高或被活化；d) 抗凝蛋白( 抗凝因子)含量减少或结构异常；e)纤溶因子含量减少或活性减弱； f)血液黏度增高和血流减慢10 。9目前肢体缺血再灌注动物模型很难造成与临床情况完全相同，因此都有一定的局限性。主要的造模方法有11：
