《外周血MSCs的分离培养及对GCSF的动员反应》由会员分享，可在线阅读，更多相关《外周血MSCs的分离培养及对GCSF的动员反应（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1外周血 MSCs 的分离培养及对 GCSF的动员反应作者：邓均，邹仲敏，张春雷，王军平，艾国平，粟永萍【摘要 】 目的 建立多种种属外周血间充质干细胞（MSCs）的分离培养方法，探讨其对粒细胞集落刺激因子（GCSF ）的动员反应。方法 用 percoll（1.131 g/mL）分离多种种属外周血单个核细胞，进行贴壁培养 MSCs。以 GCSF 作为动员剂，培养骨髓和外周血来源的 MSCs，计数动员前后的成纤维细胞集落形成单位（CFUF ） 。结果 对多种种属进行外周血 MSCs 分离培养，成功率不同。在本实验条件下，可以稳定的直接分离培养出大鼠外周血的MSCs。GCSF 动员后，骨髓来源 M
2、SCs 的 CFUF 数量显著高于对照组（P0.01） ；外周血来源 MSCs 的 CFUF 数量也显著高于对照组（P0.01） ，接近 4 倍。结论 不同种属外周血 MSCs 分离培养难易不同，其直接原因是生理条件下外周血中存在的 MSCs 量少导致的。GCSF 可以有效地动员大鼠骨髓和外周血 MSCs。 【关键词】 间充质干细胞；动员；粒细胞集落刺激因子；细胞培养Abstract: Objective To establish the isolating cultural method of MSCs from some genus peripheral blood (PB), and 2
3、explore the mobilization response of MSCs by GCSF. Methods MSCs from some genus PB were isolated by percoll (1.131 g/mL) and carried out adherent culture. MSCsderived bone marrow and PB were cultured and its CFUF were counted after mobilization by GCSF. Results PB MSCs were isolated and cultureed su
4、ccessfully or unsuccessfully from different genus. Under our experiment condition, rats PB MSCs could been isolated and cultured steadily. A significantly higher number of CFUF of BMderived MSCs and PBderived MSCs than that of control group after mobilization by GCSF（P 0.01） ，almost 4fold increase.
5、Conclusion PB MSCs were isolated and cultured successfully or unsuccessfully from different genus, it concerned with a small number of circulating MSCs in BP. We confirmed that GCSF mobilized BMderived MSCs, especially PBderived MSCs by CFUF assay.Keywords: mesenchymal stem cell; mobilization; GCSF;
6、 cell culture正常生理情况下，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）大量存在于骨髓，循环血液中仅有少量。已有研究3证实可从胎儿和新生儿血液中分离培养出循环 MSCs1 。但从成熟个体外周血中分离 MSCs，因受实验人员、环境、方法等影响，有成功2也有失败的 3 。对不同种属动物 (或人)的外周血MSCs 进行分离培养，其结果也不一样。粒细胞集落刺激因子(granulocyte colonystimulating factor，GCSF) 作为体内重要的调节因子，自 GCSF 分子克隆和基因合成成功以来，在临床上已广泛应用。而 GCSF 大量应用于白血
7、病的临床治疗，主要得益于其对造血干细胞的有效动员。那么除了动员造血干细胞外，GCSF 能否动员骨髓细胞中的 MSCs 或其他干细胞，还存在着很大争议4 。因此，本研究对不同种属的外周血 MSCs 进行分离培养，在本实验室条件下建立成熟的分离培养外周血 MSCs 的方法，并探讨 GCSF 能否有效动员外周血 MSCs。1 材料与方法1.1 实验动物及主要试剂2 月龄的健康清洁 SD 大鼠，体重 100 150 g，雌雄不拘。健康 C57BL/6 小鼠，雌雄不拘，SPF 级，6 周龄，体重 2025 g。健康日本大耳白兔。动物均由本校实验动物中心提供。MEM/F12培养基、胎牛血清（Gibco 公
8、司，美国） ，GCSF （齐鲁制药有限公司） 。41.2 外周血 MSCs 的直接分离和培养1.2.1 实验标本 为了探讨在本实验条件下，能否直接从外周血中分离培养出 MSCs，拟对小鼠、大鼠、兔、人的外周血进行 MSCs分离培养。标本分别为：C57BL/6 小鼠 4 只；SD 大鼠 4 只；日本大耳白兔外周血 4 份；人(志愿者) 外周血 4 份。小鼠和大鼠外周血标本通过剪开的股动脉采集，用肝素化管分别收集 0.8 mL和 5 mL 外周血；兔外周血标本为股动脉处抽取 5 mL 血液；人外周血标本为肘部静脉抽取 5 mL 血液。1.2.2 细胞分离和培养 分别将各外周血标本用 percoll
9、（1.131 g/mL）分离单个核细胞，制成细胞悬液，计数后以 6105 /cm2密度接种于培养瓶，置于 5% CO2、37 孵箱。48 h 后全量换液，去除悬浮细胞，以后 34 d 半量换液。细胞达 80%90%融合后，用 0.25%胰酶消化传代。1.3 GCSF 对大鼠 MSCs 的动员效应1.3.1 实验分组 2 月龄的 8 只 SD 大鼠分为 2 组。正常对照组（BMN 表示骨髓源 MSCs 对照组，PBN 表示外周血 MSCs 对照组）：4 只大鼠连续 5 d 尾静脉注射 0.9% NaCl 0.5 mL。GCSF 动员5组（BMG 表示骨髓源 MSCs 的 GCSF 动员组，PBG
10、 表示外周血MSCs 的 GCSF 动员组）：4 只大鼠连续 5 d 尾静脉注射GCSF（20 gd-1kg-1）0.5 mL。1.3.2 外周血和骨髓样本的收集培养 对照组和 GCSF 动a:大鼠外周血 MSCs；b:人外周血 MSCs图 1 直接分离、培养外周血 MSCs(100)员组 5 d 后收集骨髓样本，获取 MSCs。具体操作为，游离股骨，清除股骨周围软组织，离断股骨头。用 DMEM/F12（含 20%胎牛血清）培养基冲洗股骨头断端，制成细胞悬液，计数后以 5105 /cm2 密度接种于培养瓶，置于 5% CO2、37 孵箱。48 h 后全量换液，去除悬浮细胞，以后 34 d 半量
11、换液。细胞达 80%90%融合后，用 0.25%胰酶消化传代。外周血样本的收集：剪开大鼠股动脉，用肝素化管收集 5 mL 外周血。用 percoll（1.131 g/mL）分离单个核细胞，制成细胞悬液，计数后以 6105 /cm2 密度接种于培养瓶，以后方法同骨髓MSCs 的培养。1.4 成纤维细胞集落形成单位(CFUF) 分析细胞消化后( 第一代) 以 105 总量接种于 25 cm2 的培养瓶，培养6液为含 15%胎牛血清的 DMEM/F12，置入 5% CO2、37 孵箱。48 h 后全量换液，7 d 后，计数成纤维细胞集落形a:骨髓 MSCs 对照组；b:骨髓 MSCs 的 GCSF
12、动员组；c:外周血 MSCs 的 GCSF 动员组图 2 大鼠骨髓和外周血第一代 MSCs 的集落形成(100)a:总数为 105 骨髓来源细胞中的 CFUF 数量；b:总数为 105 外周血来源细胞中的 CFUF 数量；*: 与 BMN 比较，P0.01；:与PBN 比较，P 0.01图 3 骨髓和外周血 MSCs 的 CFUF 分析成单位（CFUF ） ，每细胞集落形成单位含 50 个以上细胞。2 结果2.1 外周血 MSCs 的直接分离和培养结果小鼠外周血标本血量太少，培养 48 h 换液后，只有少数几个散在细胞贴壁，且不能呈梭形生长，培养一段时间后逐渐死亡。大鼠外周血标本均能培养出 M
13、SCs（图 1a） 。兔外周血标本全部不能培7养出 MSCs。人外周血标本有两份标本能培养出 MSCs（图 1b） 。2.2 GCSF 对大鼠 MSCs 的动员效应成功培养出大鼠外周血来源和骨髓来源的 MSCs。观察细胞集落的形成（图 2） ，进行 CFUF 分析。结果显示 GCSF 动员后，骨髓来源 MSCs 的 CFUF 数量显著高于对照组（ P0.01） 。BMN、BMG 的 CFUF 值（s，n=4）分别为29.503.87、49.754.57。同样，经 GCSF 动员后外周血来源MSCs 的 CFUF 数量也显著高于对照组（ P0.01） 。PBN 、PBG的 CFUF 值（s，n=
14、4）分别为 7.251.26、24.752.63，PBG较 PBN 增高接近 4 倍（图 3） 。3 讨论近年来，干细胞由于多向分化的潜能而越来越受到重视，也成为细胞工程、再生医学中的主要选择细胞5 。现今 MSCs 主要是从骨髓中获取，能否从成体外周血中分离和培养出 MSCs 还没有定论23 。在不同的实验条件下，从外周血中分离和培养 MSCs 的结果也不一样。为了探讨在本实验条件下，能否直接从外周血中分离培养出 MSCs，本研究对小鼠、大鼠、兔、人的外周血进行 MSCs分离培养。结果表明即使在同样实验条件下，分离培养不同种属8MSCs 的成功率也不一样。研究显示，在培养骨髓原代 MSCs
15、时，需要接种合适的细胞量，细胞太少会减少细胞间的联系和支持，从而导致 MSCs 的滞长。在外周血 MSCs 培养过程中，本研究发现细胞培养后 2448 h 内，贴壁细胞多的可以培养成功，而贴壁细胞少的则很难培养成功。本文认为动物和人的外周血中都存在MSCs，但外周血中的 MSCs 量少直接导致了对其分离培养的困难，如小鼠的血液能取出的量不过 1 mL，所以很难培养出外周血MSCs。本实验显示在本实验条件下，能稳定地分离培养出大鼠外周血 MSCs，故以大鼠为实验模型，研究动员后外周血 MSCs 的细胞特性较可靠。循环血中虽然存在 MSCs，但要达到细胞治疗的目的，还必须利用外来因素刺激动员骨髓内
16、的 MSCs，使其大量释放进入循环血。研究显示，GCSF 是造血干细胞的有效动员剂，但对于其他干细胞如 MSCs 的动员、循环，却存在着争议。CFUF 被认为是比较成熟的 MSCs 后代和间质的前体细胞，CFUF 分析可用来评估培养体系中 MSCs 的数量。在本实验中通过 CFUF 分析，证实 GCSF 能有效动员骨髓和外周血中的 MSCs，尤其是对外周血中的 MSCs 动员更明显。可见经 GCSF 动员 5 d 后，骨髓内 MSCs 的大量增加，可能与在壁龛（niche）内处于静止的 MSCs 被激活增生有关。由于正常条件下骨髓内 MSCs 的量远远大于外周血中的 MSCs，经GCSF 动员使骨髓 MSCs 释放到外周血，就会导致外周血中 MSCs9增加量相对很高。【参考文献
