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1、1复灌时参附注射液处理可减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤作者：许鹏程，丰浩荣，戴体俊【摘要 】 目的 观察复灌时参附注射液处理对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响。方法 利用大鼠 Langendorff 离体心脏灌流模型，制备心肌缺血再灌注损伤模型，在心脏缺血后再灌注同时给予参附注射液，观察大鼠心脏左室舒张末压(LVEDP)、左室发展压(LVDP)、左室内压最大变化速率(dp/dtmax)和心率(HR),以及心肌组织中的ATP 含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、冠脉流出液中肌酸激酶(CK)含量的变化。实验分为 4 组：正常对照组、单纯缺血/再灌注组、参附注射液 30 ml/L
2、组和 60 ml/L 组。结果 缺血/再灌注组大鼠心肌 ATP 含量和 SOD 活性明显降低，MDA 和CK 含量明显升高。与缺血/再灌注组比较，参附注射液 60 ml/L 组心肌 MDA 值减少，SOD 值升高，ATP 含量增加，冠脉流出液 CK含量减少；血流动力学指标明显改善。结论 复灌时参附注射液处理可提高心肌组织 ATP 含量和 SOD 活性，减少 MDA 生成，减少 CK含量，保护缺血/再灌注后的大鼠心脏。 【关键词】 参附注射液；心肌；缺血再灌注2Abstract: Objective To investigate the effect of simultaneous treatm
3、ent with Shenfu injection (SF) during reperfusion on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats. Methods The myocardial ischemia/reperfusion model was prepared based on the Langendorff model for the perfusion of isolated rat heart. Following ischemia, reperfusion was allowed with SF injection ad
4、ministered simultaneously. The hemodynamic variables, such as left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP), left ventricular developed pressure (LVDP), rate of left ventricular pressure development/relaxation (dp/dtmax) and heart rate (HR), and the content of adenosine triphosphate (ATP), malendi
5、aldehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) in myocardial tissue and the activities of creatine kinase (CK) in coronary effluent fluid were observed. The isolated perfused rat hearts were separated into control, ischemia/reperfusion, SF 30 ml/L and SF 60 ml/L groups. Results In the ischemia/reperfusi
6、on group, the content of ATP and activity of SOD significantly decreased; the activities of MDA and CK significantly increased. SF 60 ml/L attenuated the decrease of SOD and the increase of MDA and CK compared with the ischemia/reperfusion group. SF 60 ml/L significantly 3improved the recovery of th
7、e hemodynamic variables and myocardial ATP concentrations following ischemia and reperfusion. Conclusion Simultaneous SF treatment during reperfusion could provide the cardiac protection effect against the ischemia/reperfusion injury by increasing the content of ATP and activity of SOD and decreasin
8、g the activity of MDA and CK in myocardial.Key words: Shenfu injection; myocardium; ischemia/reperfusion参附注射液是一种中药针剂,由红参和黑附片提取物组成, 主要有效成分为人参皂苷和乌头碱,目前临床已广泛用来治疗心绞痛、心肌梗死、心力衰竭等疾患，也被用于体外循环心脏瓣膜置换术1-3 。近年来，实验已证实在缺血前应用参附注射液对缺血/ 再灌注损伤心肌有保护作用4-5 。但复灌时应用参附注射液对心肌缺血/ 再灌注损伤的作用如何尚不十分清楚，本实验采用 Langendorff 大鼠离体心脏灌流模型
9、, 观察复灌后应用参附注射液对离体大鼠心脏缺血/再灌注后血流动力学以及组织中的高能磷酸化合物 ATP 含量的影响，为临床治疗用药提供实验基础。1 材料和方法41.1 实验动物健康雄性 SD 大鼠,体重 250280 g,由徐州医学院实验动物中心提供。1.2 药物与试剂参附注射液( 主要成分为人参皂甙和乌头碱,浓度分别为 0.8 g/L 和 0.1 g/L,批号 070703) 由雅安三九药业有限公司提供。ATP购自 Sigma 公司，硫酸氰四丁胺（TBAHS）购自 Aldrich 公司，考马斯亮蓝 G-250、超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛(MDA)、肌酸激酶(CK)检测试剂盒均购自南京建
10、成生物工程研究所。其他试剂均为国产分析纯。1.3 实验分组及步骤大鼠戊巴比妥钠(45 mg/kg) 腹腔注射麻醉,开胸取心,用冷灌流液冲掉残留血液,并迅速移到 Langendorff 灌流装置上,灌流液为Krebs - Hanseleit 磷酸缓冲液,灌流压为 88 kPa。灌流前用 95%氧气和 5%二氧化碳混合气体向灌流液中平衡 20 min。32 只大鼠随机分为 4 组,每组均为 8 只。正常对照组(C 组):大鼠心脏离体后接在5灌流装置上持续灌流 110 min。单纯缺氧/ 复氧组(I/R 组):大鼠心脏离体后接在灌流装置上先预灌 20 min,然后停止灌流,再恢复灌流 60 min。
11、参附注射液 30 ml/L 组和 60 ml/L 组(SF30 组，SF60 组):分别在再灌注后加入参附注射液,其他处理同单纯缺血/ 再灌注组。实验时参附注射液溶解于灌流液中,稀释的体积分数为 3.0%和 6.0%，即 30 ml/L 和 60 ml/L。灌注结束时,取心脏左室心肌组织制成 10%组织匀浆，用于心肌组织 ATP 含量、MDA 活性和 SOD 含量等测定。1.4 血流动力学指标测定左心耳处剪一小口，将带有小乳胶水囊的测压管经二尖瓣口插入左心室，连接压力换能器，经 MP-100A-CE 模数转换器(BIOPAC System, Inc, USA)与计算机相连。调节左室舒张末压为2
12、4 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa） 。Acqknowledge 4.0 软件实时采集和记录左室舒张末压(LVEDP)，并计算和显示左室发展压(LVDP)、左室内压上升/下降最大速率(dp/dtmax)和心率(HR)等。用秒表计数每分钟经冠脉流出的液体量（冠脉流量，CF,ml/min） 。1.5 ATP 测定的色谱条件流动相为 215 mmol/L KH2PO4、2.3 mmol/L TBAHS 与63.5 %乙腈组成,pH 为 6.25。流速为 0.9 ml/min。紫外检测器, 波长为 210 nm。1.6 心肌组织 MDA 活性和 SOD 含量的检测取 10%心肌组织匀浆液，
13、用硫代巴比妥法(TBA) 测定 MDA 含量，用羟胺法测定 SOD 活力。用考马斯亮蓝 G-250 测定心肌组织蛋白质的含量。操作步骤按试剂盒说明书进行。1.7 冠脉流出液 CK 含量的检测 再灌注 60 min 时收集冠脉流出液，用分光光度计测量流出液中 CK 的活性（按试剂盒说明书操作） 。1.8 统计学处理所有数据均用 Prism 3.0 统计软件进行处理 ,数据用s 表示。多组间比较应用单因素方差分析法进行分析,两两比较应用 One-way ANOVA 的 Newman-Keuls 法进行 q 检验。检验水准：=0.05。2 结 果72.1 参附注射液对缺血 /再灌注大鼠心脏血流动力学
14、的影响平衡灌注后（缺血前） ，各血流动力学指标均无显著性差异。用含有参附注射液的灌注液复灌后，SF30 组的各血流动力学指标和恢复率与 I/R 组比较也无显著性差异（P0.05） ；而 SF60 组LVEDP、LVDP、+dp/dt 和 CF 均有明显改善（5415，5110，1035240 和 11.82.3 vs. 7211,358,720206 和 8.81.9） ，它们的恢复率与 I/R 组比较也存在显著性差异（862365,479,498 和 77.613 vs. 2400390,337,369 和 5911） （P0.05） 。2.2 参附注射液对缺血 /再灌注大鼠心肌 SOD 活
15、性和 MDA生成以及冠脉流出液 CK 含量的影响与正常对照组比较，缺血/再灌注使各组心肌 SOD 活性下降，MDA 含量升高，冠脉流出液 CK 含量增加。与 I/R 组比较，SF30组的 SOD 活性、MDA 和 CK 含量无显著差异（ P0.05） ；SF60 组 SOD 活性显著升高，MDA 和 CK 含量显著下降（P0.05） ；SF60 组心肌 ATP 含量则明显升高（P0.05 ） 。表 1 各组大鼠心肌 MDA、SOD 和冠脉流出液 CK 活性的变化（略）表 2 参附注射液对缺血/再灌注大鼠心肌 ATP 含量的影响 (略)3 讨 论预先应用参附注射液无论是在体还是离体实验都显示有抗心肌缺血/ 再灌注损伤的保护作用4-6 。本实验结果显示，复灌时给予较大剂量（体积分数为 6.0%）的参附注射液处理也能改善缺血/ 再灌注后心脏血流动力学的恢复，提高心肌组织的 SOD 活性，减少MDA 生成量；增加复灌后心肌 ATP 的含量。心肌缺血/ 再灌注损伤发生机制尚未完全阐明,目前认为主要与缺血/ 再灌注时细胞内 Ca2+超载、自由基的产生及其介导的脂质过氧化反应以及高能磷酸化合物缺乏有关7-8 。因此,有效增加氧自由基清除能力及降低细胞内 Ca2+超载,恢复缺血
