《口蹄疫病毒多抗原表位基因融合表达产物的抗原性分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《口蹄疫病毒多抗原表位基因融合表达产物的抗原性分析（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1口蹄疫病毒多抗原表位基因融合表达产物的抗原性分析作者：王冬梅, 沈文涛, 黎小瑛, 周鹏【摘要 】 目的: 筛选出高抗原性的口蹄疫病毒（FMDV）抗原表位组合体, 为能有效启动细胞免疫、 高广谱性的口蹄疫植物疫苗的研究提供研究基础。方法: 通过化学方法合成 O、 A 型口蹄疫病毒的 5 个 T 细胞表位基因和 2 个 B 细胞表位基因单链, 采用套叠 PCR的方法将 T 或是 B 细胞表位基因分别融合成融合体 T 或 B, 利用同尾酶的性质将融合体 T 和 B 连接成 3 种不同融合方式的串连体 , 即5TBT3、 5TTB3和 5BTT3; 利用马铃薯 X 病毒(potato virus
2、X, PVX)载体在烟草叶片中表达各串连体基因、 融合体 T 基因、 融合体 B 基因和 O 型口蹄疫病毒的 VP1 基因; RTPCR 检测各基因在烟草 (N.benthamiana)叶片中的转录水平; 间接 ELISA 及 Western Dotblot 检测表达产物的抗原性。结果 : 各抗原基因在烟草叶片中成功获得了表达, 表达产物的抗原性因不同的融合方式而呈现差异, 其中以 5TBT3的融合方式为最高, 5BTT3次之, 再是 5TTB3, 但都高于 VP1 基因的表达产物, 更高于融合体 T 或 B 基因的表达产物。结论 : 通过融合口蹄疫病毒的多个表位基因有可能找到一种研制有效启动
3、细胞免疫反应广谱抗口蹄疫病毒的基因工程疫苗的方法, 且 T、 B 细胞表位的不2同组合方式对免疫活性很可能存在一定的影响。 【关键词】 口蹄疫病毒; 表位; 马铃薯 X 病毒; 烟草口蹄疫（foot and mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒 (footandmouth disease virus, FMDV) 引起一种偶蹄动物共患的急性、 热性、 高度接触性传染病, 被国际兽医局列为头号 A 类传染病1 。该病传播途径多、 传播速度快 , 多血清型, 曾多次在世界发生大流行, 研制一种有效启动细胞免疫反应广谱抗病毒的疫苗是成功地防控 FMD 的先决条件。人们对 FMDV 抗
4、原表位进行了广泛的研究 , 已经在 VP1 除外的其他结构和非结构蛋白上发现了某些确实能引起淋巴细胞扩增、 加强体液免疫的肽段。我们利用基因工程的手段表达这些表位基因来研制口蹄疫基因工程疫苗。在植物中表达抗原基因是一种安全、 廉价的基因工程疫苗生产方式, 目前已有较多成功的报道2-4 。利用马铃薯 X 病毒载体在烟草叶片中表达抗原基因是一种快速、 安全的表达系统, 被广泛应用在利用稳定表达系统（核遗传的表达系统）之前检测研究设计的可行性分析及多种应用性的研究中5, 6 。本研究我们在合成已经确认的 T 或 B 细胞表位基因的基础上 , 将其进行融合和串连, 利用马铃薯 X 病毒载体在烟草叶片中
5、表达不同的串连体基因、 FMDV VP1 基因等, 快速、 准确地确定各表达产物的3抗原性的免疫活性, 为通过核遗传来稳定表达抗原基因、 研制高效的植物疫苗提供可靠的依据。1 材料和方法1.1 材料 Ecoli DH5: 常规克隆宿主菌, 本实验室保存; pMD18T Vector 购于 TaKaRa 公司; 马铃薯 X 病毒载体(PVX)PGR107(Kanr)及农杆菌 GV3301PLICSa(辅助质粒, 四环素抗性, Tetr)由英国 Sainsbury 实验室 David Baulcombe 惠赠。A 和 O 型口蹄疫全毒株的标准血清(抗小鼠) 购自中国农业科学院兰州兽医所; 山羊抗小
6、鼠(IgGAP) 及显色底物购自华美生物工程公司产品购自脱脂奶粉: 完达山乳品有限公司产品, 其他化学试剂均为国产分析纯。本生烟草(N.benthamiana)由中国热带农业科学院热带生物技术研究所刘志昕研究员惠赠。1.2 方法1.2.1 各抗原表位基因单链及引物的合成(TaKaRa 公司合成)1.2.1.1 各表位基因单链合成 采用豆科植物偏爱密码子合成 A、 O 型口蹄疫结构蛋和非结构蛋白上的 7 个 T、 B 细胞表位基因: （1）A 型 FMD 3A 蛋白上的 2135 aa 位氨基酸, 4AAIEFFEGMVHDSIK, T 细胞表位, 命名为 T1; （2）A、 O 型FMD 3C
7、 蛋白上保守的 196210 aa 位氨基酸, RSMLLKMKAHIDPEP, T 细胞表位, 命名为 T2; （3）O 型 FMD VP2 蛋白上的 4968 aa 位氨基酸, SGLETRVVQAERFFKTHCYD, T 细胞表位, 命名为 T3; （4）O 型 FMD VP3 蛋白上的 81100 aa 位氨基酸, LAAKHMSNTFLAGLAQYYTQY, T 细胞表位, 命名为T4; （5）O 型 FMD VP4 蛋白上的 2040 aa 位氨基酸, TQLGDNAISGGSNEGSTDTTS, T 细胞表位, 命名为 T5; （6）A 型FMD VP1 蛋白上的 138160
8、 aa 位氨基酸, TDGPRRGDMGSLTARAAKQLPAS, B 细胞表位, 命名为 B1; （7）O 型 FMD VP1 蛋白上的 137160 aa 位氨基酸, GESPVTNVRGDLQVLAQKAARTLP, B 细胞表位, 命名为 B2。1.2.1.2 各表位基因融合引物的设计与合成 （1）所有 T 细胞表位基因融合引物设计: 据套叠 PCR 技术在基因融合中的应用原理7, 设计 10 条基因片段融合引物（ P1、 P2P10）及 2 条载体构建引物, 为了各个表位基因在表达成肽段后不相互干扰, 在引物P1P10 上引入柔性氨基酸丝氨酸(Ser, TCC)/甘氨酸(Gly,
9、GGA), 或柔性氨基酸天冬氨酸(Asn, AAT)/甘氨酸(Gly, GGA)对应的核苷酸序列; P15、 P16 为载体构建引物 , 分别引入 Cla 、 Ava 和Sal 、 Pst 酶切位点(Ava 和 Pst 为同尾酶)（2）2 个 B 细胞表位基因融合引物设计: 同理设计 4 条引物, P11、 P12 扩增 B15基因, P13、 P14 扩增 B2 基因, 在引物序列中引入酶切位点同时在2 个 B 表位基因上引入 TCCGGA 序列, 融合后在 2 个 B 表位之间加入丝氨酸(Ser, TCC)/甘氨酸(Gly, GGA) 使表达成肽段后不相互干扰发挥作用, 在 P11 和 P
10、14 上分别引入 Cla 、 Ava 和 Sal 、 Pst 酶切位点。 （3） FMDV VP1 基因的引物, P17（引入 Cla ）和 P18（引入 Sal ） 。 （4）据 PVX 载体序列设计引物 1701 和1702。1.2.2 克隆基因的 PCR 扩增1.2.2.1 Klenow 酶对各表位基因单链的延伸 将合成的各表位基因片段, 100变性 3 min, 在冰上迅速冷却, 按如下体系加入反应物, 37 延伸 30 min; 使用 Boehringer Mannheim 公司的 High Pure PCR Product Purification Kit 回收各基因片段。1.2.
11、2.2 各 T 细胞表位基因的串连 PCR 扩增 以不同的引物组合（P1、 P2P10）为引物, 分 4 次 PCR(用 Pfu 高保真酶进行)将 5个 T 细胞表位基因融合后, 再用 P15、 P16 为引物进行 PCR, 加入相应的酶切位点, 用 1.2.2.1 的方法回收, 回收产物命名为 T。1.2.2.3 2 个 B 细胞表位基因的串连 PCR 扩增 以 P11、 P12/P13、 P14 为引物 , 分 2 次 PCR 将 2 个用 B 细胞表位基因融6合并引入相应的酶切位点, 用 1.2.2.1 的方法回收, 回收产物分别命名为 B。1.2.2.4 PCR 扩增 FMDV VP1
12、 基因 以 P17、 P18 为引物, 以本实验室构建的 pBIVP1 为模板进行 PCR; 用 1.2.2.1 的方法回收, 回收产物分别命名为 VP1。1.2.3 各 PCR 产物的克隆、 转化与测序分析 将各 PCR 产物（T、 B 和 VP1）与 pMD18T Vector 载体连接, 构建克隆载体（pMDT 、 pMDB 和 pMDVP1）, 分别转化大肠杆菌, 经PCR 及酶切鉴定后, 阳性克隆送 TaKaRa 公司作测序分析。1.2.4 植物病毒载体的构建 利用同尾酶连接反应技术构建植物病毒载体。以同尾酶 Ava 和 Pst 在克隆载体 pMDT 和pMDB 上进行相应的 3 次
13、酶切, 连接和转化及鉴定 , 获得不同串连方式的中间载体; 各中间载体及克隆载体 pMDVP1 和马铃薯 X 病毒表达载体, 分别用 Cla 和 Sal 双酶切 , 以酶切后回收病毒表达载体的大片段与各目的片段连接、 转化 , 以载体引物 1701 和1702 为引物对各重组子进行鉴定; 提取阳性重组子的质粒, 电激转化法转化农杆菌感受态细胞, PCR 法鉴定获得阳性农杆菌工程菌株, 方法见文献（王关林和方宏筠, 2002） 。71.2.5 烟草的侵染 活化农杆菌工程菌株, 采用注射渗透法侵染烟草植株, 注射完毕后 , 置于 28培养箱中培养。1.2.6 利用 RTPCR 检测目的基因的转录水
14、平 利用 RNA 提取纯化试剂盒（上海华舜生物工程有限公司产品）提取烟草叶片的总RNA, 采用 RTPCR 试剂盒（Boehringer Mannheim 公司）进行反转录; PCR 以载体引物 1701 和 1702 为引物, 凝胶电泳分析 PCR产物。1.2.7 点杂交及 ELISA 检测目标蛋白的免疫原性 采用改良的丙酮沉降法提取烟草叶片总蛋白, 测定总蛋白浓度; Western Dotblot 的杂交及显色和 ELISA, 方法参照文献（王关林和方宏筠, 2002）, 每个样品加 2 个孔。一抗为 A、 O 型口蹄疫全毒株的标准血清。2 结果2.1 基因单链的合成 合成各表位基因的序列
15、为: T1: 5GCAGCAATTGAGTTCTTTGAGGGCATGGTGCATGATAGCATTAAG3; T2: 5AGGAGCATGCTTCTTAAAATGAAGGCACATATTGATCCAGAGCCA3; T3: 85AGCGGCCTTGAGACCAGAGTGGTGCAGGCAGAGAGATTCTTCAAGACCCATTGCTACGAT3; T4: 5CTTGCAGCAAAGCATATGAGCAACACCTTCCTTGCAGGCCTTGCACAGTACTACACCCAGTAC3; T5: 5ACCCAGCTTGGCGATAACGCAATTAGCGGCGGCAGCAACGAGGGCAGCACCGATACCACCAGC3; B1: 5ACCGATGGCCCAAGAAGAGGCGATATGGGCAGCCTTACCGCAAGGGCAGCAAAGCAGCTTCCAGCAAGC3; B2: 5GGCGAGAGCCCAGTGACCAACGTGAGAGGCGATCTTCAGGTGCTTGCACAGAAGGCAGCAAGAACCC9TTCCA3。2.2 病毒表达载体的构建 通过一系列的套叠 PCR 技术融合 5 个T 细胞表位基因片段, 组合后的片段命名为 T（大小约 240 bp）; 或是融合 2 个 B 细胞表位基因片段, 组合后的片段命名为 B（大小约为 150 bp）;
