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1、1变性高效液相色谱法筛选 XRCC4 基因突变作者：贾静 潘建基 苏颖, 陈增, 邹长棪 陈传本 潘才柱【摘要 】 目的 应用变性高效液相色谱技术(DHPLC) 异源双链分析对鼻咽癌患者 XRCC4 基因突变进行筛查与鉴定，研究鼻咽癌患者 XRCC4 的基因突变情况，探讨 DHPLC 在筛查相关基因突变、预测放疗敏感性方面的应用。 方法 采用聚合酶链反应(PCR)和DHPLC 筛查 88 例鼻咽癌患者 XRCC4 基因的突变。 结果 对DHPLC 图形异常的 PCR 扩增片断进行 DNA 测序鉴定突变位点及性质，检测出 28 例 XRCC4 基因 8 号外显子第 377 位 C 变成 T，导致
2、 126 号密码子的 serphe，导致氨基酸残基的替代变化(丝氨酸苯丙氨酸)。 结论 用 PCRDHPLC 筛查结合测序分析检测XRCC4 突变是一种高效、经济、简便、可靠的方法。 【关键词】 鼻咽肿瘤 辐射耐受性 突变 肿瘤细胞 培养的 DNA修复 色谱法 高压液相 基因型DNA 分子是恶性肿瘤放疗辐射作用的靶点，细胞对电离辐射反应的分子基础是 DNA 损伤1。DNA 双链断裂是放射治疗过程中的主要损伤形式，而细胞内产生的 DSBs 可以通过同源重组和非同源末端连接两种途径进行修复。未修复的 DSBs 损伤将导致细胞死2亡。近年来的研究表明，DNA 修复基因突变、单核苷酸多态性均可改变 D
3、NA 的修复能力。因此检测 DNA 修复基因的分子状态可能成为个体肿瘤放疗敏感性的预测指标。XRCC4 是 DNA 损伤修复的主要基因之一，缺乏 XRCC4 的细胞特别容易受到离子辐射的伤害。XRCC4 基因的突变可能影响肿瘤细胞的 DNA 损伤修复能力，进而影响其对辐射的敏感性以及放射治疗的疗效。因此，XRCC4 基因的突变检测可为其与肿瘤放射敏感性关系的研究以及探讨作为肿瘤个体放疗敏感性的预测指标的可行性提供研究基础。变性高效液相色谱(denaturing highperformance liquid chromatography，DHPLC)是一种高通量筛选基因组 DNA 序列变异的新手
4、段。本研究采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和 DHPLC异源双链分析与 DNA 测序等方法对 88例鼻咽癌患者进行 XRCC4 基因突变筛查与鉴定，探讨 DHPLC 检测该基因突变的适宜条件，为 DHPLC 技术在筛查相关基因突变，预测放疗敏感性的应用方面提供研究基础。1 对象和方法1.1 对象 收集 2002 年 9 月-2003 年 9 月福建省肿瘤医院放疗科经病理确诊、初治的鼻咽癌患者 88 例，男性 67 例，年龄(4812.71)岁(2176 岁);女性 21 例，年龄(4811.15) 岁(26693岁)。治疗前经鼻咽镜取鼻咽活检组织。
5、DNA 抽提试剂盒(德国Qiagen 公司 );Taq DNA 聚合酶( 金牌酶，瑞士 Roche 公司);基因扩增仪(PTC200 ，美国 BIORAD DNA ENGINE 公司);DHPLC(4500WAVE，美国 Transgenomic 公司)。1.2 方法1.2.1 基因组 DNA 抽提 用组织 DNA 抽提试剂盒抽提患者鼻咽部癌组织基因组 DNA，核酸蛋白检测仪定量，-20 保存备用。1.2.2 PCR 引物设计与合成 人类 XRCC4 基因有 8 个外显子，因为此基因突变多发生于其 1 号、4 号、7 号和 8 号外显子，其中第 8 外显子较长，需分成 2 个相互重叠的片段进行
6、扩增，故选择这4 个外显子设计 5 对引物。引物由上海博鸿生物公司合成。引物序列如下：片段名引物名引 物 序 列 Exon1RFCCGGAAAAGGCGGGATTTAGGGGGATTCTCGCATTGTGGAExon4RFGTGTATGCTTAAAACCAGGC4AACAACATAAAGAGGGCTCCExon7RFTCAATGCTAAAACAGCAAGTGATTCAAACATTTTACAATTCCExon81RFCTTTTACTCTATAACAGAAGTTATAGTTTAGAATAATGTGCCExon82RFGTGAATTGAAACCATTGTGCGGTTACATTTACATTAATAAG
7、CAGT1.2.3 PCR 反应体系及条件 PCR 反应体系 50 L，含 0.2 mmol/L dNTP，1.5 mmol/L Mg2+，DNA 模板 100 ng，Taq DNA 聚合酶 1.25 U，上下游引物各 0.2 mol/L。PCR 反应条件：94 变性 10 min94 40 s54 64 45 s 72 35 s，循环 35 次，72 延伸 10 min，PCR 产物用 1%琼脂糖(含溴化乙锭 0.5 g/mL)凝胶电泳检测。1.2.4 DHPLC 筛选 XRCC4 突变 对有效扩增的 PCR 产物行5DHPLC 筛查突变，检测 PCR 反应产物，其分离柱固相为烷基化C18，
8、中间桥分子为 TEAA，洗脱缓冲液主要成分为乙腈。标本上机之前通过软件分析序列的理论温度分离曲线，摸索出最佳的分离温度后进行突变筛选分析。1.2.5 DNA 测序 根据 DHPLC 系统检测结果，将不同峰型的PCR 产物送日本 TAKARA 公司进行 DNA 序列测定。2 结 果2.1 DHPLC 筛查结果 每份样本均检测上述 5 个片段的 PCR产物，每份样品在 50 的非变性温度下均为对称性单峰;在部分变性的温度下，1 号、4 号、7 号和 8 号外显子的 81 片断均为单个色谱峰，只有 8 号外显子的 82 片断的扩增产物出现杂合峰与纯合峰两种情况，单个色谱峰显示为纯合链，双峰或三峰表示
9、是杂合异源双链。出现杂合峰显示有突变的异源双链存在。不同样品的 PCR产物的 8 号外显子 82 段在同一 DHPLC 运行条件下突变峰形基本相同(代表峰形见图 1)，提示 8 号外显子的 82 段具有单一类型的突变。2.2 DNA 测序结果 选择 DHPLC 检测为杂合峰与单个峰的标本测序，测序结果显示 28 例患者的 XRCC4 基因第 8 号外显子第6377 位碱基 C 变成 T(图 2)。3 讨 论DHPLC 异源双链分析法是近年来才发展起来的一项新的基因突变高通量筛查技术。与其他相关技术相比，DHPLC 的 DNA 分离柱具有很好的温度稳定性和酸碱稳定性，具有很长的有效寿命(6 00
10、0 次进样)和极好的分析稳定性(99%)。DHPLC 异源双链分析法解决了 RFLP 技术受酶切位点和酶切条件的限制、扩大了检测范围、提高了检测的准确性、又解决了 SSCP 技术耗时耗力的缺点，实现了样品的自动化检测;同时检测的灵敏度、重复性和检测的通量也得到大提高，从而在基因筛查工作中具有更广泛的应用范围2。已有学者进行了 DHPLC 相关的方法学比较研究，均提示其敏感性和特异性可达 96%100%3，明显高于常用的变性梯度凝胶电泳、构象敏感性凝胶电泳、单链构象多态性分析等变异检测技术。DHPLC 突变检测技术与其它方法相比，具有更高的准确性和敏感性45。本组资料应用 DHPLC 分析鼻咽癌
11、组织 XRCC4 的突变，探讨DHPLC 检测该基因突变的适宜条件。由于 PCR 产物中杂带的存在会导致目的峰周围出现干扰峰，这些干扰峰往往会误判为突变峰形，应用 DHPLC 分析时笔者通过以下几种方法来排除干扰峰：(1)通过7优化 PCR 反应条件防止杂带产生;(2) 通过比较部分变性温度和非变性温度下的峰形来排除干扰峰，凡是在部分变性温度下呈现的双峰或多峰在 50 的非变性温度下同样表现出来，则提示有干扰峰的存在;(3)通过保留时间来判断有无干扰峰存在，因为突变引起的双峰或多峰的保留时间应相差不大。本研究通过 PCRDHPLC 筛查，共检测了 88 例患者XRCC4 基因各 5 个片段的
12、PCR 产物，在部分变性的温度下，28 例患者的 8 号外显子 82 所扩增的片段中出现杂合峰与纯合峰两种情况，经 DNA 测序分析证实单个色谱峰样本未测出突变，双峰或三峰样本检测出突变，即 8 号外显子第 377 位碱基 C 变成 T，此外，不同样品的 PCR 产物的 8 号外显子在同一 DHPLC 运行条件下突变峰形基本相同，提示 8 号外显子具有单一类型的突变。该变异导致126 号密码子的 serphe ，致使氨基酸残基发生替代变化(丝氨酸苯丙氨酸)，这一替代对改变 DNA 修复能力的作用以及是否影响鼻咽癌细胞 DNA 损伤修复能力和放射治疗疗效，还有待于进一步的研究探讨。【参考文献】1
13、 Shrivastav M, De Haro L P. Regulation of DNA doublestrand break repair pathway choiceJ. Cell Res, 2008,18(1):134147.82 Yeh H M, Tsai M C,Su Y N,et al. Denaturing high performance liquid chromatography screening of ryanodine receptor type 1 gene in patients with malignant hyperthermia in Taiwan and
14、identification of a novel mutation (Y522C)J. Anesth Analg, 2005,101(5):14011406.3 Fackenthal D L, Chen P X, Das S. Denaturing highperformance liquid chromatography for mutation detection and genotypingJ. Methods Mol Biol, 2005,3110(5):7396.4 Tseng C P,Huang C L,Chong K Y,et al. Rapid detection of gl
15、ucose6phosphate dehydrogenase gene mutations by denaturing highperformance liquid chromatography J. Clin Biochem, 2005,38(11):973980.5 Panayiotou K,Kaprara A ,Sarika L,et al. Efficient testing of the RET gene by DHPLC analysis for MEN 2 syndrome in a cohort of patientsJ. Anticancer Res，2005,25(3B):20912095.
