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1、1厄贝沙坦抑制高浓度葡萄糖诱导的脂质氧化效应和人脐静脉血管内皮细胞损伤作者：鲁敏，卢群，任燕，田刚【摘要 】 目的 探讨厄贝沙坦对高浓度葡萄糖诱导的脂质氧化效应及人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)损伤的影响。方法 取生长良好的 HUVEC 进行实验。将细胞分为 4 组：正常浓度葡萄糖对照组(葡萄糖终浓度为 5.5mmol/L)、高糖组(葡萄糖终浓度为 33.3mmol/L)、厄贝沙坦干预组和抗氧化剂 N乙酰半胱氨酸 (Nacetylcysteine, NAC)干预组。干预组首先用厄贝沙坦(10-5mol/L)和NAC(10mmol/L)分别预作用 1h，而后加入 33.3mmol/L 葡萄糖共
2、同孵育 24、48、72h。分别采用 TBARS 法和分光光度比色法检测培养上清液中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶 (SOD)活性。结果 与正常浓度葡萄糖组比较，高糖组 MDA 含量显著升高(P0.01)，SOD 活性明显降低(P0.01); 高糖作用 24h 时MDA 含量已达到较高水平(P0.05)。与高糖组比较，厄贝沙坦组和 NAC 组MDA 含量均显著下降(P0.05)，SOD 活性则均明显升高(P0.05)。与高糖组比较，厄贝沙坦组和 NAC 组各时点细胞凋亡率均显著降低(P0.05)，高糖对 HUVEC 细胞形态的损伤明显2减轻。结论 厄贝沙坦部分通过抑制氧化应激作用降低高浓
3、度葡萄糖诱导的脂质氧化效应，保护 HUVEC。 【关键词】 厄贝沙坦;葡萄糖;低密度脂蛋白;氧化应激;动脉粥样硬化ABSTRACT: Objective To discuss the influences of irbesartan on high glucoseinduced lipid oxidation effect and human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) injury. Methods HUVECs of the logarithmic phase were divided into four groups: normalco
4、ncentration glucose control group (glucose final concentration of 5.5mmol/L), highglucose group (glucose final concentration of 33.3mmol/L), irbesartan intervention group, and antioxidant Nacetylcysteinyl acid (NAC) intervention group. The intervention groups were first treated with irbesartan (10-5
5、mmol/L) and NAC (10mmol/L) for 1h, respectively, then coincubated with high glucose (glucose final concentration of 33.3mmol/L) for 24h, 48h and 72h. Malondialdehyde (MDA) content and superoxide dismutase (SOD) activity of culture supernatant were determined by TBARS method and spectrophotometric as
6、say, respectively. Results MDA content increased significantly 3(P0.01) and SOD activity decreased significantly (P0.01) in high glucose group compared with control group. MDA content reached a considerable level (P0.05). Compared with that in high glucose group, MDA content significantly decreased
7、(P0.05) and SOD activity significantly increased (P0.05) in irbesartan and NACtreated groups. Apoptosis of HUVECs was significantly reduced (both P95% ，待次日细胞贴壁后，改用无血清的DMEM 培养基培养 8h 后开始实验分组。1.2.3 实验分组 将 HUVEC 分为 4 组，每组设 6 个平行孔(n=6)：正常浓度葡萄糖对照组 (葡萄糖终浓度 5.5mmol/L);高糖组(葡萄糖终浓度 33.3mmol/L);厄贝沙坦干预组;NAC 干预组。
8、干预组用厄贝沙坦(10-5mol/L)3 和 NAC(10mmol/L)分别预作用1h，而后加入 33.3mmol/L 葡萄糖共同孵育 24、48 、72h。1.2.4 人天然低密度脂蛋白的提取 取健康人血浆，按张林华等3一次性密度梯度超速离心法提取。以牛血清白蛋白(1g/L)为标准品，用 Lowry 法测定蛋白浓度。1.2.5 细胞上清液中 MDA 含量和 SOD 活性的测定 按试剂6盒说明书的要求先求出样本的最佳加样量。HUVEC 经上述同样处理后，取细胞上清液，按试剂盒说明书的要求测定各样本的吸光度，并依下列公式计算出 MDA 含量和 SOD 活性。MDA 含量(mol/L)=(测定管吸
9、光度-测定空白管吸光度)/( 标准管吸光度- 标准空白管吸光度)标准品浓度(10mol/L)样本测试前稀释倍数 ;SOD 活性(u/mL)=(对照管吸光度 -测定管吸光度)/对照管吸光度50% 反应体系的稀释倍数样本测试前的稀释倍数。1.2.6 细胞凋亡率的测定 按 ANNEXIN VFITC 凋亡检测试剂盒说明测定。具体步骤如下：将收集的细胞用冷 PBS 洗涤 2 次，然后用结合缓冲液重新悬浮细胞，浓度为 1106 细胞/mL;移液器吸取 100L 溶液置 5mL 培养管; 加入 5L 的 ANNEXIN VFITC 和5L 的碘化丙啶 (propidium iodide, PI);轻轻地摇
10、匀细胞，室温下避光孵育 15min;每管加入 400L 结合缓冲液，1h 内用流式细胞仪测定细胞凋亡率。1.3 统计学处理 所得数据均用 SPSS 11.5 软件进行统计处理。计量资料采用均数标准差(s)表示，所有数据经正态分布及方差齐性检验后，多组间均数比较用方差分析，两组间均数比较采用方差分析两两比较。P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果72.1 细胞形态学观察 荧光显微镜下观察，正常 HUVEC 为扁平单层小三角形、短梭形，细胞边界清楚，透明度高，胞质丰富，密集处呈铺路石状镶嵌排列，稀疏处为短梭形，紧密贴壁，细胞核呈圆形或椭圆形, 偶见双核 (图 1A)。高浓度葡萄糖作用 72h
11、后细胞形态改变，细胞变为椭圆形或圆形，贴壁细胞有部分皱缩，细胞密度明显下降，颗粒增多，大小不匀，间隙增大，甚至细胞脱落溶解(图 1B)。10-5mol/L 厄贝沙坦( 图 1C)和 10mmol/L NAC(图 1D)分别干预 72h，细胞损伤明显减轻，颗粒减少，连接紧密，边界清楚，细胞形态基本接近正常。2.2 脂质过氧化修饰 与正常浓度葡萄糖组比较，高糖组MDA 含量显著升高(P0.01)，SOD 活性明显降低 (P0.01)，说明高浓度葡萄糖具有一定的促脂质氧化作用。高糖作用 24h 时，与正常浓度葡萄糖组比较，MDA 含量已达到较高水平(P0.05)。与高糖组比较，厄贝沙坦组和NAC 组 MDA 含量均显著下降(均 P0.05)，SOD 活性则均明显升高(P0.
