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1、1依达拉奉预处理离体乳鼠脑皮质细胞对脑缺血再灌注损伤的保护作用【摘要】 目的： 探讨不同浓度依达拉奉预处理离体乳鼠脑皮质细胞对脑缺血-再灌注损伤的保护作用。方法： 取出生 24 h 以内的新生 SD 乳鼠的脑皮质细胞,体外培养至第 7 天，随机分为 5 组：A 组（正常对照组） ；B 组（药物损伤组） ；C1 组（50 mol/L 依达拉奉预处理组） ；C2 组（100 mol/L 依达拉奉预处理组） ；C3 组(200 mol/L 依达拉奉预处理组)。C1、 C2 、C3 组第 7 天用依达拉奉预处理，24 h 后 B、 C1 、C2、 C3 组予 200 mol/L 谷氨酸损伤 0.5 h
2、，所有组换正常培养液继续培养 24 h 后观察神经细胞存活率（MTT 法） 、乳酸脱氢酶（LDH）漏出率、细胞凋亡率和 HE染色后倒置相差显微镜下细胞形态变化。结果： 依达拉奉预处理各组 MTT 含量不同程度高于损伤组，LDH 漏出量和凋亡细胞百分比不同程度低于损伤组，倒置相差显微镜下见预处理组细胞形态受损较药物损伤组轻，3 个预处理组以 C2、C3 组效果明显，但两组差别无统计学意义。结论： 采用所测浓度的依达拉奉提前 24 h 预处理离体幼鼠脑皮质细胞，对脑缺血-再灌注损伤有明显的保护作用。 【关键词】 依达拉奉; 脑缺血； 缺血预处理； 细胞凋亡； 乳酸脱氢酶; 再灌注损伤2Abstra
3、ct Objective: To study the protective effect of edaravone pretreatment against cerebral ischemia-reperfusion caused injury in cultured cortical cells of suckling rat brain. Methods： Cortical cells of SD rat within 24 hours after birth were cultured for 7 days, and then were randomly divided into 5 g
4、roups: group A (control group), group B (ischemia-reperfusion group), groups C1, C2, and C3 (edaravone pretreatment groups, 50umol/L for group C1, 100umol/L for group C2, 200 mol/L for group C3). After cells in groups C1, C2, and C3 were treated by corresponding dosages of edaravone for 24 hours, gl
5、utamate (200 mol/L) was added into culturing media of groups B, C1, C2, and C3. In half an hour later, culture media of all groups were substituted by fresh normal medium. After another 24 hours, cortical cell survival rates, LDH efflux rates and cell apoptosis rates were determined, and the cell mo
6、rphous was observed with the help of HE staining. Results： The survival rates were higher, and the LDH efflux rates and apoptosis rates were lower in edaravone groups than those of group B; The cell destruction in edaravone treated groups was lighter than that in group B. The protective results of g
7、roups C2 and C3 was obvious, and there was no significant difference between the 32 groups. Conclusions： The pretreatment of edaravone with the tested concentrations in 24 hours before has obvious protective effect to cultured cortical cells against the cerebral ischemia-reperfusion caused injury;Ke
8、y words edaravone; brain ischemia; ischemic preconditioning; apoptosis; lactate dehydrogenase; reperfusion injury脑血管疾病是我国人群致死的第三大因素,是首位致残疾病，且发病率呈逐年上升趋势，其中缺血性脑血管病占绝大部分，缺血性脑血管病尤其是脑缺血后的再灌注损伤危害极大。预处理是近 20年研究减轻缺血再灌注损伤的途径之一，它先后经历了缺血预处理、化学预处理、药物预处理的发展过程，因药物预处理具有相对安全、使用方便、易控制等优点，与其它预处理方法比较具有潜在的临床应用价值，成为研究保护
9、缺血再灌注损伤的一种新途径和发展趋势。2007 年 5 月10 月通过培养乳鼠脑皮质细胞，用不同浓度的依达拉奉提前 24 h 对其进行预处理，谷氨酸制作缺血再灌注损伤模型，观察不同浓度的依达拉奉对缺血脑细胞的保护效果1 材料和方法41.1 材料新生 SD 乳鼠（出生 24 h 内）由贵阳医学院实验动物中心提供；DMEM/F12 培养基（HyClone 公司,美国） ，标准胎牛血清（天津市海洋生物制品科技有限公司） ，异丙酚（北京费森尤斯卡比医药有限公司） ，依达拉奉（南京先声东元制药有限公司） ，即用型SABC 免疫组织化学染色试剂盒 （武汉博士德生物工程有限公司） ，LDH 测试盒（南京建成
10、生物工程研究所第一分所） ，MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（凯基生物科技发展有限公司） 。1.2 乳鼠大脑皮层神经细胞原代培养取出生后 1 d 之内的新生 SD 乳鼠, 碘酒和 75%的酒精消毒皮肤后取双侧大脑皮质,剔除软脑膜和血管，D-hanks 液冲洗两遍，用眼科剪剪成 1 mm3 左右的块状，终浓度 0.125%胰蛋白酶常温下消化 35 min,边消化边用巴士管吹打，至肉眼看不到细胞团块，立刻用培养基终止消化，200 目筛网过滤成单细胞悬液，细胞计数板计数；加培养基适量，调细胞浓度为 105106/L 的细胞悬液，接种于 96 孔培养板、24 孔培养板、盖玻片、50 ml 培养瓶中
11、。置 37 、5%CO2 培养箱中孵育，第 3 天用含 2.5 g/L 阿糖胞苷1培养基换液,抑制神经胶质细胞及纤维细胞生长，第 6 天用培养基换液，准备大脑皮质神经细胞鉴定和实验分组。51.3 实验分组随机分为 5 组：A 组（正常对照组） ，B 组（药物损伤组） ，C1 组（50 mol/L 依达拉奉预处理组） ，C2 组（100 mol/L 依达拉奉预处理组）和 C3 组(200 mol/L 依达拉奉预处理组)。1.4 大脑皮质神经细胞鉴定大脑皮质细胞体外培养至第 7 天,取出 24 孔培养板内的盖玻片，参照即用型 SABC 免疫组织化学染色试剂盒说明书操作，然后观察。1.5 药物预处理
12、脑皮质细胞体外培养至第 7 天，C1 组、C2组、C3 组去掉原培养基, 分别加入 50 mol/L 依达拉奉培养基、100 mol/L 依达拉奉培养基、200 mol/L 依达拉奉培养基，继续培养 24 h。1.6 谷氨酸（Glu ）毒性神经细胞损伤模型建立培养 8 d 的皮层神经细胞去掉原培养基,B 组、C1 组、C2 组、C3 组加入含 Glu的无血清培养基(Glu 终浓度 200 mol/L)作用 0.5 h，D-Hanks 冲洗两遍后,各组均换含 10%胎牛血清的 DMEM/F-12 培养基,继续培养 24 h。1.7 指标检测（细胞生长至第 9 天）61.7.1 MTT 法测定神经
13、细胞存活率将接种细胞的 96 孔板，每孔加 50 lMTT,在 37 孵育 4 h，使 MTT 还原成甲月赞，吸出上清液，每孔加 150 l 二甲基亚砜（DMSO）使甲月赞溶解，轻轻震荡，使其充分溶解，酶标仪在550 nm 波长处检测每孔的光吸收值（ OD） ，减去本底 OD 值，然后按下式计算细胞存活率：细胞存活率=（加药组细胞 OD 值/对照组细胞 OD）100% 。1.7.2 LDH 漏出率的测定24 孔培养板吸取每孔培养液，参照试剂盒说明书测定各孔中OD 值；留下的 24 孔培养板，加培养液，其量与吸取量相同，用力吹打，显微镜下见细胞基本无存活，参照试剂盒说明书测定各孔中OD 值。根据
14、公式计算 LDH 漏出率2，细胞培养液 LDH 漏出率=培养液 LDH 的 OD 值/（培养液 LDH 的 OD 值+细胞匀浆液 LDH的 OD 值）100%。1.7.3 细胞凋亡率将各组细胞消化离心后收集于离心管,制成单细胞悬液,按凋亡试剂盒要求加入试剂,6 h 内用流式细胞仪上检测凋亡。71.7.4 HE 染色倒置相差显微镜下观察神经细胞的形态学变化。1.8 统计学处理量化指标以（xs）表示，分析组间差异显著性用 SPSS13.0统计软件进行方差分析和 q 检验，P0.05 表明有显著性差异。2 结果2.1 大脑皮质神经细胞鉴定细胞生长至第 7 天，进行神经元特异烯醇化酶（NSE）免疫组织
15、化学染色，阳性着色为棕黄色。本实验反应呈阳性，说明所培养细胞是脑皮质细胞（如图 1） 。2.2 神经细胞存活率、LDH 漏出率、凋亡率正常对照组与损伤组比较 P0.01；C1 组与损伤组比较 P 0.05，C2 组、C3 组与损伤组比较 P0.05 或 P0.01；C2 与 C3 组比较 P0.05，见表 1。表 1 各组神经细胞存活率、LDH 漏出率、细胞凋亡率比较（略）注：与正常对照组相比，(1)P0.01；与药物损伤组相比，(2)P0.05，(3)P0.05，(4)P0.01；两组相比， (5)P0.05。82.3 细胞形态 HE 染色显示，正常生长 9 d 的神经元突起明显，并交织成网
16、状，胞体较大，多数细胞呈锥体型，双极型、三极型多见,偶见单极型；圆形, 折光性强,有明显立体感, 突起增粗并出现末端分支。Glu 处理后神经细胞明显损伤,大部分细胞胞体变小，突起皱缩、减少甚至消失、折光性减弱,细胞核破碎、部分细胞甚至溶解, 但仍有少数细胞保持正常形态。依达拉奉预处理组神经细胞形态与药物损伤组相比细胞损伤程度较轻。见图 2、3 、4、5、6。3 讨论缺血再灌注损伤是一个复杂的病理过程，是多因素交互起作用的，兴奋性氨基酸大量释放学说是缺血再灌注损伤机制比较公认的学说之一，本试验用谷氨酸建立缺血再灌注损伤细胞模型。结果显示损伤组的细胞存活率明显下降、凋亡率明显上升、LDH 漏出率明显增高。HE 染色观察 Glu 酸损伤组神经细胞受损非常严重，可能与下列机制有关。 （1）缺血后兴奋性氨基酸介导大量 Na+,Cl-及H2O 内流，造成细胞水肿坏死 ;（2 ）激活 N-甲基 D-门冬氨酸受体（NMDAR）
