《门冬酰胺合成酶启动子区单核苷酸多态性与基因表达量的相关性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《门冬酰胺合成酶启动子区单核苷酸多态性与基因表达量的相关性研究（14页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询门冬酰胺合成酶启动子区单核苷酸多态性与基因表达量的相关性研究【摘要】 细胞内门冬酰胺合成酶（asparagines synthetase， AS）的表达水平与白血病细胞对左旋门冬酰胺酶（Lasp ）耐药有关。本研究旨在通过筛查发现 AS 启动子区的单核苷酸多态性（SNP）位点，研究它们对 AS 基因表达量的影响及寻找对 Lasp 治疗反应具有影响的个体遗传因素。 对 82 份白血病标本和 45 份非白血病标本直接测序，筛查 AS 启动子区的 SNP；用实时定量 PCR 法测定相应标本中的 AS mRNA 水平。通过对被筛 SNP 位点不同基因
2、型个体的 AS 表达水平的统计分析，判断被筛 SNP 是否对基因表达产生影响。结果发现： 被测 AS 启动子片段内共发现 3 个 SNP 位点。分别是-239C/T，-92G/A 和-62A/T。其中-92A 等位基因在白血病患儿中的发生频率高于非白血病(P 0.05)。AS 表达在该 SNP 的各种基因型个体间存在差异，基因表达水平由高到底依次为 GA 杂合子型 AA 纯合子型 GG 纯合子型（P 0.01） 。结论： -92A 等位基因变异可能与白血病的某些特征相关，并且这个等位基因变异的存在与 AS 基因的高表达相关。 【关键词】 急性白血病； 门冬酰胺合成酶； 启动子区； 单核苷酸多态
3、性精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询Single Nucleotide Polymorphism in the Promoter Region of Asparagine Synthetase and Its Impact on the Gene ExpressionAbstract High expression of cellular asparagine synthetase (AS) is a causative factor for the resistance of leukemic cell to Lasparaginase therapy. This stud
4、y was aimed to find single nucleotide polymorphism (SNPs) in the promotor region of asparagine synthetase (AS) gene and to determine if these SNPs have influence on the transcriptional activity of AS promotor. The DNA sequences of AS promoter (pAS) from 82 leukemic children and 45 controls were dete
5、rmined to screen for SNPs in this region and the AS mRNA level in these samples was quantified using realtime PCR assay. The results indicated that three SNPs were found in the sequenced pAS fragment. They were 239C/T ， 92G/A and 62A/T respectivdy. The frequency of 92A allele was higher in leukemic
6、samples than that in nonleukemic control (P 0.05). The gene expression level differed among the individuals with genotype of the 92G/A 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询SNP, and the descending order was as follows: GA heterozygote AA homozygote GG homozygote. It is concluded that some features in leukemia m
7、ight associate with SNP on 92A locus, and this SNP in pAS can be one of the factors influencing transcriptional activity of AS gene. The existence of the 92A allele variant contributes to a high expression of AS gene.key words acute leukemia; asparagine synthetase; promotor region; single nucleotide
8、 polymorphism左旋门冬酰胺酶（Lasp ）是儿童急性淋巴细胞白血病(ALL) 和 T 细胞性淋巴瘤化疗方案的重要组成部分。对 Lasp 耐药的 ALL患儿往往长期预后较差1，2 。Lasp 作用机制是通过分解血浆中的天门冬酰胺和谷氨酰胺，导致细胞内氨基酸的缺乏从而抑制细胞的增殖。然而大多数细胞通过表达门冬酰胺合成酶(asparagines synthetase, AS)利用细胞内的天门冬氨酸、谷氨酰胺和 ATP 重新合成上述氨基酸从而维持细胞生命和增殖。已有研究证实，细胞内 AS的表达高低与细胞对 Lasp 的耐药密切相关3, 4 。精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页
9、查询此外，Lasp 在临床上为一个引起较多严重不良反应的化疗药物，因此围绕该药药物疗效和药物代谢方面个体差异的研究有着重要的意义。本研究旨在筛查人群中 AS 基因调控区的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNP)，并研究这些。材料和方法研究对象82 份白血病患儿骨髓标本取自诱导缓解治疗之前，其中 3 份为复发白血病标本。临床病例包括 ALL 53 例，ANLL 26 例，CML 3 例。骨髓形态学检查显示，4 份标本的幼稚细胞比例低于 70%，8 份在 70%-80%之间，剩余 70 份标本的幼稚细胞比例均在 80%以上。非白血病标本 45 份，
10、其中 6 份为骨髓，其余为外周血。研究方法精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询基因组 DNA 抽提 用 TRIZOL 试剂（Invitrogen 公司产品）抽提骨髓标本总 RNA，同时抽提 DNA。外周血标本的 DNA 用酚氯仿法抽提。AS 启动子片段的扩增 AS 基因全长序列从 Ensemble 网站下载。扩增片段范围从转录起始点上游（-297 bp）至第一内含子内（+225 bp）,全长 523 bp。引物用 Primer 5.0 软件设计，由上海生工生物工程公司合成。上游引物： 5 CCTCACGCATCAGTTTCTTA3 ；下游引物：5TCCTCCACCCCTTCCT
11、TCCG3 。用 TaKaRa 的 LaTaq with GC Buffer kit 进行扩增，体系为 25 l，循环参数： 94 30 秒；56.5 30 秒；72 45 秒，35 个循环。扩增片段由英骏生物技术公司进行电泳分离纯化及序列测定。因部分标本在割胶后仍显示非特异序列的干扰，对这些标本进行巢式 PCR，第一轮扩增后的产物以 150 稀释，取 0.5 l 加入第二轮扩增体系。第二轮PCR 的上游引物同第一轮，下游引物： 5AAGCAGGTCAGGGTGATGTGGC3 ，片段长度 424 bp。扩增体系 25 l: 10buffer (Mg2+plus) 2.5 l, dNTP 0.
12、25 mmol/L, 引物各 0.2 mol/L, ExTaq HS(5 U/l) 0.125 l。循环条件： 94 2 分钟启动 HS ExTaq，然后 94 变性 30 秒，55退火 30 秒，72延伸 45 秒，循环 35 次。精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询骨髓细胞 RNA 提取及 cDNA 合成 骨髓单个核细胞按 TRIZOL 试剂说明书提取总 RNA。RNA 沉淀用含无 RNase 的 DNase I 溶液TaKaRa，体系为每 50 l 溶液中，10DNaseI buffer 5 l, DNase I (5 U/l) 2 l, RNase inhibitor(
13、40 U/l) 0.5 l,其余为 DEPC 水重悬并根据吸光值调整浓度至 1 g/l。 37孵育 20 分钟后置冰浴。每份标本取 2 l 模板进行反转录。反转录体系 20 l,模板 2 l 先 70变性 10 分钟，再加入 18 l 反转混合物（各成分及浓度按 Promega 试剂说明） ，45延伸 45 分钟。最后 95加热 5 分钟。反转录产物用双蒸水稀至 100 l 保存在-20。AS mRNA 的实时荧光定量 PCR/Taqman 探针法测定 AS 和内参照GAPDH 的 cDNA 序列从 GenBank 获取。探针和引物序列（表 1）用Primer Express 2.0 软件设计
14、后由 TaKaRa 公司合成标记。实时定量 PCR 的体系为 25 l: 5Buffer 5 l, dNTP 0.3 mmol/L, Mg2+ 5 mmol/L, ExTaq HS(5 U/l) 0.25 l, cDNA 5 l,引物各 0.3 mol/L，探针 0.12 mol/L。循环条件： 95 5 分钟激活 ExTaq 酶，然后每个循环 95 15 秒，60退火加延伸 45 秒，进行 45 个循环。标准曲线用 HepG2 细胞的 cDNA 以 14 倍比稀释建立，精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询标准品模板和待测模板均以复管进行扩增。扩增反应在 ABI Prism 7
15、000 序列探测仪上进行。AS 和内参照的起始模板量值用相对定量双标准曲线法分别算出。AS mRNA 的定量用 AS 的起始模板量除以内参照的起始模板量的比值表示。统计学处理各 SNP 在不同标本组中的频率分布差异用 RC 表、2 检验。各组间 AS mRNA 定量差异用成组多样本秩和检验。上一页 1 2 下一页AS 基因转录控制区 SNP 的检测AS 基因据已公布的数据有 3 种转录剪切方式。本研究以转录本NM183356 5端 1 号外显子第 1 个碱基为1。按已有报道，AS的转录调控核心区位于-88+120，主要为 1 号外显子及其上游区域，此区为 AS 基因基础转录和受氨基酸缺乏上调表
16、达所需的最小序列范围5 。本研究扩增的片段范围为-297+126，共发现 3 处 SNP 位点。其中 2 个转换，分别是-239C/T， -92G/A； 1 个颠换，-精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询62A/T。-239C/T 已为 dbSNP 数据库公布（rs3757676） ，-92G/A 和-62A/T 为新发现的 SNP 位点。-92AA（变异型纯合子）全部与-239CC（野生型纯合子）偶联。-239TT（变异型纯合子）则全部与-92GG（野生型纯合子）偶联。3 个 SNP 位点在白血病和非白血病患儿基因组中的分布频率-239C/T 和-62A/T 的基因型频率和等位基因频率在白血病和非白血病组之间无显著差异。-92G/A 各基因型频率和等位基因频率在白血病和非白血病组间存在统计学差异（两种频
