《镧示踪甘露醇开放大鼠血脑屏障机制的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《镧示踪甘露醇开放大鼠血脑屏障机制的实验研究（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询镧示踪甘露醇开放大鼠血脑屏障机制的实验研究【摘要】 目的：研究甘露醇高渗性开放大鼠血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）的机制。方法：采用静脉内注射 0.5 mL 2%硝酸镧作为外源性示踪剂，10 min 后颈内动脉注射 37 20%甘露醇3.0 mL 开放 SD 大鼠 BBB，通过外源性硝酸镧透射电镜示踪法观察BBB 超微结构改变，研究热点区域包括注射侧与对侧大脑皮层。结果：实验组（注射 20%甘露醇组） ，镧（La3+）在同侧大脑半球皮质区充填并通过脑血管内皮细胞（BMECs）之紧密连接（TJs）至血管腔外-脑间质裂隙
2、内，对侧大脑半球皮质区局部有 La3+渗出至基底膜（BM） ；对照组则完全封闭于血管腔内（P 0.05） ；各部位胞浆内均无 La3+。结论：20%甘露醇通过开放 TJs 导致 BBB 通透性增高，同侧大脑半球强于对侧大脑半球。 【关键词】 BBB 通透性 超微结构 甘露醇Abstract Objective：To investigate the mechanisms of osmotic BBB disruption induced by intra-carotid artery infusion of mannitol. Methods：Male SD rats underwent int
3、ravenous administration of 0.5 mL 2% lanthanum nitrate over 2 minutes.Ten minutes later,warm 20% mannitol was 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询intra-arterially infused at a rate of 0.1 mL/second over 30 seconds.The interesting spots included cortical tissues within the ipisilateral and opposite hemisphere
4、of the brain respectively. The ultrastructure of BBB was observed by lanthanum nitrate-tracing transmission electronic microscope.Results：In the brain tissues of control group,La3+ is excluded from TJs. However,for the trial group, TJs in the opposite hemisphere of the brain were completely infiltra
5、ted with La3+and extravasation to the basement membrane was seen in certain sites of the capillaries; La3+penetrated the cellular gaps of endothelia and seeped in the basement and interstitial spaces in ipisilateral hemisphere of the brain（P 0.05）.No La3+was seen in the cytoplasm of cerebral microve
6、ssel endothelial cells both in trial and control groups. Conclusion： Opened TJs result in the enhanced permeability of BBB induced by intra-arterial infusion of mannitol.Key words BBB；Permeability；Ultrastucture；Mannitol精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询大量研究表明：颈内动脉注射甘露醇所致的渗透性开放是非选择性的可逆性开放，且无组织损害 。但目前关于渗透性开放
7、BBB的途径与机制尚存争议。本研究采用颈内动脉注射甘露醇开放 SD 大鼠 BBB，通过外源性硝酸镧透射电镜示踪法观察 BBB 超微结构改变，探讨 BBB 开放的途径。1 材料与方法1.1 材料健康雄性 SD 大鼠 10 只（体重 250 g300 g） ，四川大学华西医学中心基础实验动物中心提供；硝酸镧（成都化学试剂厂） 。1.2 硝酸镧示踪电镜观察甘露醇开放 BBB 之超微结构改变SD 大鼠 2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（40 mg/kg）颈部切口分离出右侧颈外静脉，用微型注射器缓慢注入 0.5 mL 0.9%NS-2%硝酸精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询镧（2 min）
8、（硝酸镧的量和浓度与正常血脑屏障匹配）循环时间为 10 min颈内动脉置 PE-50 聚乙烯管，37 20%甘露醇 0.1 mL/s 持续 30 s 颈内动脉注射循环时间为 10 min开胸及心包膜，经左心室插管至升主动脉，右心房开小口，先用肝素化 37 0.9% NS 150 mL 快速心脏灌流冲洗血液至无色（流出液基本清亮） ，随后镧醛固定液（2%多聚甲醛-2.5%戊二醛-2%硝酸镧-0.1M 二甲砷酸钠（CBS）持续灌流固定 20 min，灌注压 1.0 kPa开颅取全脑，选取不同部位组织切成小块，投入上述镧醛固定液中继续固定 2 h。用含镧的 0.1 M CBS（2%硝酸镧-0.1 M
9、 CBS）浸洗 3 次（10 min/次） 。1%锇酸后固定，经含镧的 0.1 M CBS 浸洗 3 次（10 min/次）后，丙酮逐级脱水，包埋，修块，半薄切片光学显微镜定位，制备超薄切片，电子染色，最后电镜观察。其中，组织取材分为两组：双侧大脑半球皮质，每一区域随机取样 3 处。光镜下不能看到镧盐，故随机取样分析，以毛细血管丰富区域为超薄切片制备区域。对照组以0.9% NS 替代 20%甘露醇，余步骤相同。1.3 结果判定(1)血管对硝酸镧不通透的标准：La3+沉积于血管管腔面，管腔外无 La3+（-） ；(2)血管对硝酸镧通透的标准：La3+出现在以下部精品文档欢迎来主页查询更多精品文档
10、,欢迎来我主页查询位局部 BM(+)；广泛 BM() ；血管周围脑间质裂隙内() 。1.4 统计学方法数据采用 SPSS10.0 软件进行统计学分析。同侧大脑皮质、对侧大脑皮质和对照组大脑皮质三部位血管对 La3+渗出之间的比较采用成组设计两样本比较的秩和检验，P 0.05 为差别具有显著性意义。上一页 1 2 下一页2 结果实验组同侧大脑半球脑组织可见高电子密度的 La3+通过 BMECs之 TJs，主要分布在毛细血管的内皮下层，并通过 BM 广泛到达血管周围脑间质裂隙内，管腔内残留 La3+附着于血管壁，BMECs 胞浆内无 La3+。对侧大脑半球脑组织局部可见 La3+渗出至 BM，但未
11、发现血管外脑间质裂隙内 La3+；对照组脑组织 BMECs 之 TJs 完整，管腔内 La3+密集排列，管腔外无 La3+（见图 1图 4） 。经成组设计两样本比较的秩和检验，实验组同侧大脑半球脑组织 实验组对侧大脑半球脑组织 对照组大脑半球脑组织（ P 0.05） （见表 1） 。表 1 硝酸镧精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询示踪电镜观察 BBB 开放3 讨论正常脑血管内皮细胞膜结构为致密的脂质双分子结构，膜上有14 A18 A的微孔，分子直径大于 18 A的物质不易透过 BBB入脑，脑 BBB 的结构对维持脑内环境稳定起着重要作用， 。临床上已应用甘露醇破坏 BBB，增
12、加化疗药转运治疗脑肿瘤， 。但目前关于渗透性开放 BBB 的途径与机制尚存争议。有学者认为是闭锁小带分离、细胞间 TJs 增宽所致，其机制涉及高渗透压诱导 BMECs 皱缩、血管舒张，以及影响第二信使系统细胞内Ca2+引发细胞骨架和 TJP 收缩状态的改变，这种细胞骨架和第二信使系统的变化可能与 BBB 的短暂可逆性开放有关。但也有学者认为渗透性开放 BBB 包括 TJs 开放和胞饮作用增强。镧作为超微结构水平常用的示踪物，是一种高电子密度的重金属。硝酸镧分子量 433，其颗粒平均大小约 40 埃，可进入除 TJs 外的细胞连接，且在细胞膜通透性正常时只存在细胞外间隙而不能进入细胞内，故常用于
13、判断组织细胞间是否存在 TJs 屏障功能及细胞膜通精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询透性改变的研究。本研究通过颈内动脉注射 20%甘露醇开放 SD 大鼠 BBB，采用外源性硝酸镧示踪透射电镜法对微血管超微结构和屏障功能改变进行深入观察，结果表明：颈内动脉注射 20%甘露醇可诱导 BBB 通透性增加，屏障功能损害，实验组从毛细血管 TJs 管腔侧-BM-血管周围脑组织间质裂隙存在连续 La3+沉积；而对照组脑组织 BBB 完整，La3+均匀附着于血管腔内，没有 La3+渗出，表明 La3+本身不影响 BBB。同时我们发现各部位脑血管内皮细胞胞浆内均无 La3+。说明 La3+可
14、能不是经胞饮作用穿行 BMECs，而是经细胞侧隙途径，即 BBB 的 TJs渗出到血管外。血管 TJs 开放程度与 La3+渗漏密切相关，微血管超微结构损害愈重，TJs 开放越显著，血管基膜外乃至组织间隙内La3+分布越广泛。对于对侧大脑半球脑组织存在轻度 La3+渗出，表明甘露醇的 BBB 开放范围为整个大脑半球，对侧由于 Willis 环亦可有少许作用。据此，我们认为颈内动脉注射 20%甘露醇诱导的 BBB通透性增高与 TJs 开放密切相关，TJs 是保持 BBB 完整性的重要因素。当然，目前研究表明：甘露醇开放 BBB 尚存在一时间窗的问题。Rapoport等实验证实：大鼠 BBB 在注
15、射高渗性甘露醇后 15 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询min 内开放程度最大，此后迅速下降，2 h 内复原。Siegal 等采用 99mTcGH 的 SPECT 法研究人脑肿瘤表明：渗透性开放BBB 对小分子物质的关闭时间比早先估计者延迟，渗透压破坏后最初 40 min 内 BBB 广泛开放， 6 h8 h 后复原，这就界定了 BBB 不完全恢复的敏感时段，即治疗的时间窗。研究肿瘤及肿瘤周围脑组织 TJs 通透性的调节在脑胶质瘤综合治疗中具有深远意义，通过调节 BMECs 之 TJs 开放联合化疗可增进目前脑肿瘤化疗的效果。 【参考文献】 Tooru Inoue, Mas
16、ashi Fukui, Shunji Nishio,et al.Hyperosmotic blood-brain barrier disruption in brains of rats with intracerebrally transplanted RG-C6 tumor. J Neurosurg,1987,66:256263 Bradbury MWB. The structure and function of the blood-brain barrier. Fed Proc,1984,43:186 Bradbury MWB. The blood-brain barrier, transport 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询across the cerebral endothelium. Cir Res,1985,57:213 Doolittle ND, Mi
