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1、1丙酮酸氧化酶速率法在大批量献血员 ALT 检测中的应用【摘要】 目的：丙酮酸氧化酶速率法适用于大批量献血员 ALT 的检测。方法：利用丙酮酸氧化酶氧化丙酮酸生成过氧化氢，过氧化氢与 2,4,6 三溴-3-羟基苯甲酸（TBHBA）和 4-氨基氨替比林（4-AAP）在过氧化物酶作用下生成红色醌类化合物。结果：该方法线性范围达 200 U/L，与紫外酶偶联速率法比较，相关系数r=0.991， y=1.072x1.032，n=90。结论：该方法操作简单、快速，结果准确，灵敏度高，重复性好，特别适合血站大批量献血员ALT 检测。 【关键词】 献血员；ALT；丙酮酸氧化酶速率法目前，各级血液中心、血站常
2、用的丙氨酸氨基转移酶(ALT)简称转氨酶检测方法有赖氏法、速率法、酮体粉法，但由于赖氏法(60 min)反应时间较长，酮体粉法准确性差，速率法对仪器要求较高等特点，均不适用于基层血站大规模的无偿献血活动1。我站自 2005 年以来用丙酮酸氧化酶速率法，该方法使用基层血站必备的酶标仪即可，而且操作简单、快速，具有较高的准确性和精密度，非常适合基层血站大批量献血员 ALT 的控制。21 材料与方法1.1 仪器酶标仪（Multiskan MK3，芬兰 Labsystems 公司） ，TDA40FA 全自动生化分析仪（日本东芝公司） 。1.2 试剂 ALT/GPT 试剂盒（江西瑞华倍肯医学制剂有限公司
3、，批号20050921，20060205） 。1.3 质控血清江西瑞华倍肯医学制剂有限公司提供，经全自动生化分析仪确认，低值血清(L) ： 51 U/L，高值血清(H)：103 U/L。1.4 反应原理L-丙氨酸-酮戊二酸 ALT 丙酮酸 L-谷氨酸，丙酮酸O2P 丙酮酸氧化酶 H2O2乙酰磷酸，H2O2 4-AAPTBHBA 过氧化物酶红色醌类化合物。31.5 测定方法取 96 孔酶标板上，A1 孔为试剂空白、B1 孔为标准，C1 及D1 孔为质控，A2H12 孔为测定。于 A1 孔内加蒸馏水 20 L，于 B1 孔内加标准血清 20 L；C1 及 D1 孔分别加低值及高值质控血清 20 L
4、；A2H12 孔内分别加受检血清 20 L，然后各孔加工作液 200 L，混匀，置 37 反应 10 min 时第一次比色吸光度为A1 及 13 min 时第二次比色吸光度为 A2(用双时测量模式即二点测量模式)，主波长为 492 nm，次波长为 620 nm，计算各孔吸光度之差值(A2-A1)。ALT 活性(U/L)=测定孔吸光度/标准孔吸光度标准血清(U/L)2 结果与讨论2.1 线性取 1 份 ALT 活性 200 U/L 的血清，用生理盐水稀释为不同浓度按本法操作，结果在 200 U/L 内呈线性。详见表 1。表 1 ALT活力测定值（略）2.2 方法比较4选择检测生化常规标本 90
5、份，分别用本法 (y)和日本东芝TDA40FA 全自动生化分析仪紫外酶偶联速率法(x) 用上海久强试剂盒测定血清 ALT，两法相关系数为 r=0.991，y=1.072x1.032。2.3 精密度取 2 份低值、高值质控标本，批内重复测定 20 次，低值标本=51 U/L，SD1.1，CV2.1 %；高值标本 103 U/L，SD2.0，CV1.94 %。批间重复，将标本存 4 冰箱，每天重复测定 4 次，共测定 20 次，低值标本=51 U/L，SD1.5，CV2.9 %；高值标本103 U/L，SD2.9，CV2.8 %，显示该方法的精密度和重复性较好。2.4 反应稳定性上述 90 份标本
6、，在 37 反应 10 min 后，进行 3 min、4 min、6 min、8 min、10 min、13 min、15 min、17 min 测定，发现 3 min、4 min、6 min 测得的结果基本不变，8 min 以后值偏低，说明第二次显色结束，36 min 内比色结果可靠。2.5 酶反应试剂稳定性5酶反应试剂于 4 保存，可使用 2 周，酶活性测定结果不变。2.6 干扰因素的消除 (1)该法主波长为 492 nm，次波长为 620 nm，使用双波长可有效克服溶血、脂血的干扰2。(2)该法为获取反应 10 min 与13 min 内两个时间点内的差值，可有效抵消溶血、脂血的影响。3 结论丙酮酸氧化酶速率法与紫外偶联速率法有很好的相关性，且仪器要求较低，大大降低了实验成本，非常适合血站大规模地检测献血员 ALT。【参考文献】1 吴敏，朱荐，何亚琴.快速全血生化分析仪用于 ALT 快速初筛的评价J.中国输血杂志， 2004，17(1):27.2 刘玉振，陶玉生，温涛，等.双波长微孔板赖氏测法 ALT含量J.中国输血杂志， 2000，13(1):29-30.
