《丙型肝炎病毒多表位抗原的原核表达及免疫原性分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《丙型肝炎病毒多表位抗原的原核表达及免疫原性分析（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1丙型肝炎病毒多表位抗原的原核表达及免疫原性分析作者：孙文佳, 赵红玲, 刘龙丁, 董承红, 纳锐雄, 赵树栋, 李琦涵【摘要 】 目的: 研究丙型肝炎病毒(HCV) 十表位抗原 HCVe 在大肠杆菌中的非融合表达及其免疫原性分析。方法: 在大肠杆菌DH5 中表达非融合蛋白 HCVe, 纯化该蛋白后利用 Westerb blot分析其抗原反应性。免疫小鼠, 检测其免疫特异性。结果: HCVe 十表位抗原能在原核表达系统中高效表达。Western blot 和 ELISA 分析表明 HCVe 十表位抗原能与 HCV 病人阳性血清特异性结合, 并可诱发小鼠产生特异性 HCV 抗体。结论: 表达的
2、HCVe 十表位抗原具有特异的抗原反应性及免疫原性。 【关键词】 丙型肝炎病毒; 多表位抗原; 体液免疫丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)是经血液途径传播的一类肝炎病毒。目前全球约有 1.7 亿2.0 亿 HCV 感染者, 此感染者中70%85%可发展成为慢性感染, 病程长达 2030 年1, 约有 30%可发展成为进展性肝病, 包括肝硬化或肝癌2。目前, 对 HCV 慢性感染尚无高效的特异性治疗方法, 标准治疗方案是聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗 2472 周, 由于干扰素和利巴韦林副作用巨大, 2使部分患者无法耐受而提前终止治疗3。因此迫切需要研发一种有效疫苗来预
3、防 HCV 感染。由于 HCV 复制力差、 感染力弱, 基因组高度变异, 并且缺乏有效的细胞和动物感染模型, 因此采用传统方法研制丙肝疫苗难以达到目的4。以抗原表位预测和人工合成抗原表位基因为基础的多表位疫苗是近年来新的研究趋势5, 表位肽虽然微小, 但免疫原性强 , 可以克服主要组织相容性复合体 (major histocompability complex, MHC)分子的遗传限制, 同时多表位疫苗在诱生细胞免疫和克服免疫应答中的不利因素方面有着独特优势, 为特异性免疫治疗和基因治疗奠定了基础, 因此多表位疫苗成为HCV 预防和治疗性疫苗的研究突破点。我们将已合成好的 HCV 十表位抗原复
4、合体在原核表达载体 pBV220 中成功表达, 建立了纯化技术路线, 并对该多表位抗原的抗原反应性做了分析, 同时利用小鼠对其免疫原性进行了初步探索。1 材料和方法1.1 材料 大肠杆菌 DH5 均由本实验室保存, 带有丙型肝炎多表位抗原基因的质粒 pBV220HCVe 由本实验室构建。限制性内切酶购于大连宝生物工程有限公司。纯化用分离介质购于Pharmacia 公司。HCV 抗体诊断试剂盒购于英科新创(厦门)生物科技有限公司。丙型肝炎患者阳性血清来自昆明医学院第一附属医院。BALB/c 小鼠 , 雌性, 68 周龄, 购于医学生物学研究所灵长类实验3动物中心。1.2 方法1.2.1 pBV2
5、20HCVe 的鉴定 将已连好的 pBV220HCVe质粒, 转化 DH5 感受态细胞, 酶切鉴定, 筛选阳性克隆。1.2.2 pBV220HCVe 的诱导表达及表达产物的纯化 挑取含重组子 pBV220HCVe 的阳性克隆于含 Ampicillin 的 LB 液体培养基中 30振荡过夜, 次日按 1100 的比率扩大培养 23 h 后, 迅速升温至 42诱导培养 46 h, 离心收集菌体, 经 150 g/L SDSPAGE 检测, 考马斯亮蓝染色, 确定目的蛋白的表达量及相对分子量大小, 挑选表达量最高的优势菌种划线涂板, 以备后用。温度诱导菌体经超声波破碎, 用 1 mol/L、 2 m
6、ol/L 尿素逐级洗涤包涵体沉淀, 离心回收沉淀, 将沉淀溶于 8 mol/L 尿素, 再用 1 mol/L DTT 和 10 mmol/L PB 缓冲液对洗涤后的蛋白沉淀进行稀释复性。用硫酸铵分级沉淀方法从复性液中沉淀浓缩杂蛋白, 后经 Sephadex G25 脱盐柱脱盐、 DEAE Sephrose Fast Flow 离子交换层析、 Sephadex S200 排阻层析柱纯化 , 150 g/L SDSPAGE 分析其纯度, 福林酚法测定蛋白浓度, -20保存备用。1.2.3 HCVe 抗原反应性分析 将纯化的 HCVe 蛋白进行 150 4g/L SDSPAGE 电泳, 当目的蛋白迁
7、移到适合位置时结束电泳, 将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。以 10 g/L BSA 封闭非特异性结合位点, 反应 1 h, 37与丙型肝炎患者阳性血清(150 稀释)结合, 反应2 h, 经 TTBS 清洗 3 次后, 37与碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG(150 稀释)结合 , 充分洗膜, DAB 显色, 观察结果。1.2.4 HCVe 免疫效果分析 将 68 周龄、 雌性 BALB/c 小鼠, 随机分为 4 组, 10、 50、 100 g 组, PBS 对照组, 每组 6 只。取纯化的 HCVe 蛋白按 10、 50、 100 g 组, 以氢氧化铝(1 g/L)为佐剂, 皮下注射, 分别免疫
8、BALB/c 小鼠, 免疫后 1 个月加强免疫1 次, 共免疫 2 次。免疫后第 2、 6、 8 周采集小鼠尾静脉血, 分离血清, 用 HCV 抗体诊断试剂盒检测各组实验组小鼠 HCV 特异性抗体的产生情况。2 结果2.1 pBV220HCVe 重组质粒的鉴定 重组质粒pBV220HCVe 经过 EcoR I 酶切后, 得到 501 bp 的预期片段( 图 1)。序列测定结果与设计序列完全一致。2.2 HCVe 的表达及纯化 将经温度诱导表达的 HCVe 进行SDSPAGE 电泳, 发现诱导菌体与空载体菌体蛋白表达有明显差异, Mr 14 700 附近有明显的差异蛋白条带(图 2), 与理论预
9、期值大小一5致。诱导 5 h 时, 菌体表达量最高。对表达菌体经超声波破碎后的沉淀和上清的 SDSPAGE 胶的分析表明, HCVe 主要分布在细菌裂解液的包涵体沉淀中。经过一系列纯化步骤, HCVe 的纯度已达到80%。2.3 HCVe 抗原反应性分析 结果显示转移至硝酸纤维素膜上的 HCVe 蛋白可与特异性抗体结合, 表明重新构建的 HCVe 蛋白具有良好的特异性 HCV 抗原反应性( 图 3)。2.4 HCVe 免疫效果分析 采用 HCV 抗体诊断试剂盒检测实验小鼠 HCV 特异性抗体产生情况 , 表明各剂量组在 HCVe 第 1 次免疫后 2 周, 各剂量组小鼠均产生抗 HCV 特异性
10、抗体 , 2 免后第 1 次采血检测(第 6 周)10 g 及 50 g 剂量组小鼠特异性抗体滴度均均有增加, 尤其以 100 g 剂量组增加最为明显, 第 2 次采血(第 8 周), 10 g 及 50 g 剂量组小鼠特异性抗体滴度有所下降, 但 100 g剂量组小鼠特异性抗体滴度显著增加(图 4)。图 4 不同 HCVe 剂量免疫小鼠体内诱导产生的特异性抗体3 讨论多表位疫苗, 指通过筛选与组合优势抗原表位(包括 T 细胞、 6B 细胞表位)基因, 以能产生高效细胞、 体液免疫应答进而清除病毒为目的的新型疫苗。其优势在于通过选择最具免疫保护潜力的表位以覆盖尽量多的病毒亚型和诱导全面的机体抗
11、病毒免疫应答, 并尽量减少无关、 干扰和抑制序列可能产生的负面影响。目前, 国内外的研究者们在 HCV 多表位疫苗的研究中都取得了一定成果。黄建生等6在 HCV 基因组中选取 5 个高度保守的 T、 B 细胞表位, 设计成一个 HCV 多表位抗原基因 PCX, 克隆至真核表达载体, 免疫小鼠和家兔可诱发高水平的特异性细胞和体液免疫应答。和绍清等7利用原核表达载体表达 GZPCX 多表位抗原基因, 经纯化后免疫恒河猴, 诱发了机体高水平的体液免疫应答, 并且抗体持续时间长。本实验室前期工作中, 利用 HCV 结构及非结构蛋白上 7 个保守的核心表位, 构建了包括 T 细胞位点及 B 细胞位点的重
12、组抗原表位多肽, 其基因为 429 bp, 编码 142 个氨基酸 , 对其原核表达的纯化蛋白进行分析后, 发现该抗原能够在小鼠及灵长类动物体内诱导特异性的抗体反应和 CTL 反应8。本研究结合 NS3 有关抗原表位在抗 HCV 免疫反应中具有重要意义的研究结果9, 在前期七表位序列基础上增加了两个具有保守意义的 NS3 抗原表位和一个 NS5 抗原表位。根据 HCV 免疫反应的主要效应机制为细胞免疫, 以 T 细胞表位为主、 B 细胞表位为辅, 分别从 HCV 六个基因型中选取具有代表意义的保守表位, 理论上可7以代表 HCV 的基本抗原结构。根据现有资料, 本研究在十个表位之间使用了铰链区
13、作为间隔, 以保证各表位有充分的空间旋转可能。实验结果表明, 该重组抗原表位多肽 HCVe 能够在原核表达系统 pBV220 载体中高效表达, 表达的目的蛋白存在于包涵体中, 8 mol/L 的尿素即可溶解大部分目的蛋白, 经过 DTT 复性及一系列纯化步骤, 即可获得纯度在 80%以上的目的蛋白。实验结果显示, 该蛋白可以在原核表达系统中稳定表达, 因此该抗原可在低成本情况下进行大规模生产, 为后期灵长类动物实验提供充足的免疫原。实验通过 Western blot 分析, 证实了 HCVe 蛋白可以与HCV 患者阳性血清产生特异性抗原反应, 说明该重组抗原表位多肽具有良好的抗原反应性。动物实
14、验结果显示, 该重组抗原表位多肽能够在小鼠体内诱发高滴度的抗体。从两次免疫情况看, 第 1 次免疫后, 100 g HCVe 蛋白产生的抗体滴度较低 , 但第 2 次免疫后, 即产生较高滴度的抗体。100 g 剂量组免疫小鼠后, 抗体产生平均水平高于 10 g 及 50 g 剂量组, 第 2 次免疫后, 抗体滴度明显高于第一次免疫, 从而证实了 HCVe 重组抗原表位多肽能够在小鼠体内诱发特异性体液免疫应答。2 免后第 2 次采血检测 (第 8 周), 10 g及 50 g 剂量组小鼠特异性抗体水平有所下降, 而 100 g 剂量组小鼠特异性抗体水平持续增长, 表明 100 g 剂量能够较好的
15、持续引起小鼠体内产生特异性抗体。另外, 该动物实验使用的佐剂为氢氧8化铝, 这也证明, 氢氧化铝能够很好的起到延长抗原作用时间, 持续释放抗原所引起的刺激性免疫应答, 为今后进一步的灵长类动物实验打下了良好的实验基础。如果在后期的灵长类动物实验中也能取得良好的免疫效果, 该多表位抗原将具有进入临床研究的价值及可能性, 并有望成为抗 HCV 感染的候选疫苗。【参考文献】1 Seeff LB. Natural history of chronic hepatitis CJ. Hepatology, 2002, 36(5 Suppl 1): S35-46.2 Thomson BJ, Finch RG
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