蛋白质工程在医学中的应用及其发展前景

蛋白质工程在其诞生以来就在人们生活的方方面面起到了很大的作用，它的应用主要是在在医药，食品加工，轻工业，农牧业等方面，为社会的发展进步提供了不容忽视的力量，这将预示着蛋白质工程将在以后的社会发展中有着良好的发展前景。 随着 20 世纪 70 年代初期 DNA 基因工程的诞生，蛋白质工程在它的冲击下应运而生。1983 年，美国 Genex 公司 K.Ulmer 在《Science 》上发表以 《Protein Engineering.》为题的专论，第一次提出了蛋白质工程的概念，并建立了专门的研究实体，制定了相应研究开发计划，标志着蛋白质工程的正式诞生。在以后的二十多年里，蛋白质工程有了长足的发展且应用于医学，农业，轻工等各个领域，产生了较大的经济效益和社会效益。 一．蛋白质工程在医药中的的医用 基因工程为实现蛋白质工程已经提供了基因克隆、表达、突变以至活性测定等关键技术，而蛋白质分子的结构分析、结构设计和预测为蛋白质工程的实施提供了必要的结构模型和结构基础。蛋白质工程的实施实际上是一个由理论到实践、由实践到理论的周而复始的研究过程，对蛋白质的结构—功能关系的规律性认识是一个螺旋式上升的过程。蛋白质工程不但有着广泛的应用前景，而且在揭示蛋白质结构形成和功能表达的关系研究中也是一个不可替代的手段。 （1）蛋白质工程在医药中的应用 1 抗体工程的应用 抗体工程的出发点是改善抗体的特异性、亲和性以及在受体细胞中的可生产性。当然也包括使其特性扩展，可同时作用于不同的抗原。对于很多应用而言，只改变亲和性是不够的。在一些应用中，特别小的抗体片段是必需的；鼠抗体必须改成人抗体；再者，增加抗体分子对蛋白酶的稳定性以及正确折叠都是重要的考虑。 下面以一个特异性结合实体瘤的单克隆鼠抗体为例。这种抗体对高度特异性肿瘤治疗而言是很理想的，它可以将免疫毒素带到瘤细胞中，从而杀死瘤细胞。由于完整的抗体分子太大，不能最大限度地扩散到瘤体中，以致不能完成治疗目的。为此，必须将抗体分子变小，抗体的最小片段 Fv 就成了最佳候选分子。然而 Fv 本身不稳定，这样抗体运载体 Fy和所携带的毒素可能在到达目的地之前就分开。因而，首先要使其稳定化；然后抗体的亲和性要尽可能高，这是因为抗体对抗原(即瘤细胞) 的结合越好，所携带的毒素错误地在身体内传布的危险性就越小，抗体更能达到其目的地。然而，如果病人的免疫系统将这个鼠源抗体识别 为外源蛋白质，则几天之后由于 HAMA 反应产生的人抗鼠抗体就阻断了携带毒素的鼠抗体到达瘤细胞之路，使免疫治疗归于失败。为了解决这一问题，就要对抗体进行改造。近年来，用大肠杆菌系统有效地表达所需要的特定功能的抗体技术取得突破，向人们提供了具有全新性质的医用抗体片段。以上就是对鼠源抗体改造的路子。 如上所述，由于 HAMA 免疫反应直接从具有特异性结合活性的鼠源单抗在治疗中的作用就受到限制。由于绝大多数 HAMA 抗体是抗鼠源抗体的恒定区，使人们想到产生嵌合抗体可能解决上述问题，即将鼠单抗的恒定区换成人抗的恒定区。由于人抗体基因和鼠抗体基因都可以分别进行克隆，利用 PCR 技术很容易将鼠单抗可变区与人的恒定区重组到一起，所得到的嵌合抗体仍然能特异性地结合抗原，而 HAMA 反应被减少。由于这样的嵌合抗体的恒定区(或恒定结构域 )来源于人，因而它对于激活人免疫系统的某些辅助功能更有效，则可有效地激活依赖于抗体的细胞的细胞毒性(ADCC) ，这就是某些像这样的人源化抗体已经用到临床实验的原因。 如前所述，抗体的人源化可很明显地减低 HAMA 反应，但也产生少数抗鼠可变结构域的人抗鼠抗体(HAMA 抗体 )。从抗体的结构图中可以看出抗体的可变结构域可以分成为超变区( 即互补性决定区 CDRs)和变化性较少的骨架区，而与抗原的结合是由超变区决定的。与超变区相比，这些骨架区是保守的，这些有限的骨架区的氨基酸序列由一个紧密相关的基因家族编码。这种结构特点使人们想到，是否可以将鼠抗体的超变区嫁接到一个相关的人抗体可变结构域的骨架部位，这就是所谓的超变区嫁接的设计。按着这一种设想产生的第一个抗体，其亲和性比它的前体(鼠抗体) 明显地降低。随着对许多不同抗体的三级结构认识的扩大，CDR 嫁接所得到的结果也随之改善。现在，几个完全人源化抗体的亲和性已与鼠抗体几乎没有差别，用这样的抗体作为治疗制剂也再不受 HAMA 反应的困扰。 这些研究也对抗体的结构功能研究有很大促进，发现了在抗体可变区某些氨基酸是很重要的，某些氨基酸的配对对可变区的稳定性和正确折蠢是不可替代的。在人源化抗体的操作中，这些氨基酸都不能改变。这些发现体现了蛋白质工程操作从理论到实践，再由实践到理论的过程。 总之，通过抗体的蛋白质工程可以对具有特定结合活性的鼠源抗体人源化，为疾病的治疗提供安全可靠的药物。此外还可以通过同源融合、异源融合产生各种双功能抗体用于临床的治疗。人抗鼠抗体(HAMA)检测试剂盒2，抗体酶的应用 抗体酶是研究酶作用机理的有力工具。酶抑制剂的研究支持了 Pauling 过渡态理论，但它只能提供作用过程中结合专一性的信息，不能给出结合后发生催化反应以及结合与催化之间的关系。抗体酶实验则弥补了这一缺陷。除了基础理论研究的价值，抗体酶的应用前景也令人鼓舞。Lerner 指出，若将催化水解反应的抗体酶研究深入下去，极有可能得到一种新型蛋白酶，这种抗体酶在医学上可用来专一破坏病毒蛋白质及清除体内“垃圾”。Lerner 还提到，将具有立体专一性的抗体酶应用于制药工业，将有助于解决对映体拆分的难题。随着制备抗体酶新方法的不断发展，抗体酶的催化反应的范围将进一步拓宽特别是对那些天然酶不能催化的反应，则可研制抗体酶来进行催化。 其次，抗体酶的研究，为人们提供了一条合理途径去设计适合于市场需要的蛋白质，即人为地设计制作酶。这是酶工程的一个全新领域。例如：利用动物免疫系统产生抗体的高度专一性，可以得到一系列高度专一性的抗体酶，成为针对性强、药效高的药物，于是生产高纯度立体专一性的药物成为现实。又如：以某个生化反应的过渡态类似物来诱导免疫反应，产生特定抗体酶，以治疗某种酶先天性缺陷的遗传病。抗体酶还可有选择地使病毒外壳蛋白的肽键裂解，从而防止病毒与靶细胞结合。另外，抗体酶的固定化已获得成功，将大大地推进工业化进程。 3，融合蛋白质的应用 脑啡胀(Enk)N 端 5 肽线性结构是 δ 型受体结合的基本功能区域，干扰素(IFN) 是一种广谱抗病毒抗肿瘤的细胞因子。黎孟枫等人化学合成了 Enk N 端 5 肽编码区，通过一连接3 肽编码区与人 α1 型 IFN 基因连接，在大肠杆菌中表达了这一融合蛋白。以体外人结肠腺癌细胞和多形胶质瘤细胞为模型，采用 3H—胸腺嘧啶核苷掺入法证明该融合蛋白抑制肿瘤细胞生长的活性显著高于单纯的 IFN，通过 Naloxone 竞争阻断实验证明，抑制活性的增高确由 Enk 导向区介导。 4，蛋白质工程酶的应用 蛋白质酶工程在医学上的应用相当成功。人体的消化功能依靠胃肠运动的机械性消化和消化酶作用的化学性消化来完成。消化液中含有大量消化酶，可促进食物中糖、脂肪、蛋白质的水解。由大分子物质变为小分子物质，以便被人体吸收利用。葡萄糖、甘油、甘油-酯、氨基酸等都是可溶解的小分子物质，可被小肠吸收。临床中，消化酶不足既可引起广泛的消化不良症候群，如胃肠胀气、胃饱胀、恶心、腹痛 、腹泻、厌食等症状，还影响营养物质的消化和吸收，造成低蛋白血症、脂肪性腹泻、脂溶性维生素缺乏、内分泌紊乱等。药物消化酶则可以有效地解决这方面的疾病。消炎酶，溶菌酶，抗肿瘤酶等蛋白酶也在疾病的治疗中各有其不同，为生命工程的发展做出了巨大贡献。注射用胰蛋白酶α-葡糖苷酶 溶菌酶消炎酶 力克舒胶囊是一种加酶抗感冒药。具有解热镇痛、消炎止咳效果。力克舒胶囊最大特点是配方中加入消炎酶，它是从菠萝汁或其茎汁水中提取的一种蛋白水解酶。力克舒主要针对感冒症状，对鼻咽部卡他症状（如鼻塞、流涕、咽充血、痰涎等）。二，蛋白质工程的发展前景 蛋白质工程研究，从２０世纪８０年代初至今，由于分子生物学和技术科学相结合，已经完成了几十种蛋白质分子结构的改造。在蛋白质结构与其功能的研究上已获得很多有价值的检测资料。人们已经初步掌握了蛋白质工程的技术程序，这就是基因定位、诱变。在了解蛋白质三维结构与功能的基础上，对突变后的一维纤性肽链进行分子设计，从而构建全新的蛋白质分子。当今，在这个技术程序的控制手段方面已经取得了关键技术的突破。当前，蛋白质工程是发展较好、较快的分子工程。这是因为在进行蛋白质分子设计后，已可应用高效的基因工程来进行蛋白的合成。最早的蛋白工程是福什特（Forsht）等在 1982—1985 年间对酪氨酰—t —RNA 合成酶的分子改造工作。他根据 XRD（X 射线衍射）实测该酶与底物结合部位结构，用定位突变技术改变与底物结合的氨基酸残基，并用动力学方法测量所得变体酶的活性，深入探讨了酶与底物的作用机制。佩里（Perry）1984 年通过将溶菌酶中 Ile(3)改成 Cys(3)，并进一步氧化生成 Cys(3)-Cys（97）二硫键，使酶热稳定性提高，显著改进了这种食品工业用酶的应用价值。1987 年福什特通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的 Asp（99）和 Glu（156）改成 Lys，而导致了活性中心 His（64）质子 pKa 从7 下降到 6，使酶在 pH=6 时的活力提高 10 倍。工业用酶最佳 pH 的改变预示可带来巨大经济效益。蛋白工程还可对酶的催化活性、底物专一性、抗氧化性、热变性、碱变性等加以改变。由此可以看出蛋白工程的威力及其光辉前景。上述各例是通过对关键氨基酸残基的置换与增删进行蛋白工程的一类方法。另一类是以某个典型的折叠进行“从头设计”的方法。1988 年杜邦公司宣布，成功设计并合成了由四段反平行 α—螺旋组成为 73 个氨基残基的成果。这显示，按人们预期要求，通过从头设计以折叠成新蛋白的目标已是可望又可及了。预测结构的模型法，在奠定分子生物学基础时起过重大作用。蛋白的一级结构，包含着关于高级结构的信息这一点已日益明确。结合模型法，通过分子工程来预测高级结构，已成为人们所瞩目的问题了。 蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。 蛋白质工程取得的进展向人们展示出诱人的前景。例如，科学家通过对胰岛素的改造，已使其成为速效型药品。如今，生物和材料科学家正积极探索将蛋白质工程应用于微电子方面。用蛋白质工程方法制成的电子元件，具有体积小、耗电少和效率高的特点，因此有极为广阔的发展前景。总结：总而言之，蛋白质工程作为生物工程领域的一向重要技术和发展方向，在 21 实际的社会发展中将会有更多的蛋白质工程的技术和产品应用到我们的日常活动中，为我们提供极大的便利，解决许多重大的难题，为社会进步和经济发展起到重大的推动作用。