《与人遗传病相关的三核苷酸重复序列(GAA)n·(TTC)n自然遗传突变研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《与人遗传病相关的三核苷酸重复序列(GAA)n·(TTC)n自然遗传突变研究（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1与人遗传病相关的三核苷酸重复序列(GAA)n(TTC)n自然遗传突变研究【摘要】 目的:研究含重复序列(GAA)n(TTC)n 的菌体在传代培养中氨苄青霉素对其遗传突变的影响。方法:采用分子克隆、PCR 等分子生物学实验技术。结果：在 100 mL LB 液体培养基中加入 100 mg/mL 氨苄青霉素 35 L 对重复序列有明显删减。结论：治疗与重复序列相关的神经系统遗传疾病可以通过促进重复序列的有效删减，将重复序列数目控制在阈值之内来完成。 【关键词】 遗传病;重复序列;自然突变Abstract Objective：To explore the impact of ampicillin
2、on genetic mutations of (GAA)n(TTC)n repeat sequence bacteria in the passage culture. Methods: Molecular cloning, PCR and other molecular biological techniques were used in the study. Results: 100mg/ml ampicillin35l added to 100ml LB liquid medium remarkably deleted the repeat sequences. Conclusion:
3、 Treatment of genetic diseases of nervous system associated with repeat sequence can be achieved by promoting the effective deletion of repeats and keeping the number of repeats within the control threshold.2Key words Genetic disease; Repeat sequence; Natural mutation迄今为止近 40 种神经系统遗传病的发生可能与三核苷酸重复序列的
4、扩增有关1，如弗里德赖希共济失调与重复序列(GAA)n(TTC)n 的大量扩增有关2。正常人体内存在一定的重复序列，重复序列达到一定数目以上才会引起疾病。治疗与重复序列相关的神经系统遗传疾病的可行性方案是抑制重复序列的扩增或促进重复序列的有效删减，将重复序列数目控制在阈值之内，这对生物学研究及临床医学有非常重要的意义。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 生物材料与试剂大肠杆菌 DH5、pUC19 质粒均为内蒙古大学实验室提供，含有重复序列(GAA)28 的大肠杆菌、限制性核酸内切酶(BamH、 EcoR、Pvu)、T4 噬菌体多核苷酸激酶、RNaseA、T4 DNA 连接酶均购自 TaKaR
5、a 公司，PleI 酶购自 NEB3公司，质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒购于天根公司。其他试剂为国产(分析纯) 。1.1.2 实验仪器高速冷冻离心机(Eppendorf 5810 R)，凝胶成像仪(GENE-GENIUS)，紫外-可见分光光度(Nanodrop)计，槽体冷却加热器(PHC-19 型 )，台式离心机(TGL-16 C)，超纯水仪(Bioscience-UBL214715)，电热恒温培养箱(DHP-9272)。1.2 方法1.2.1 克隆策略化学合成寡核苷酸重复序列(GAA)7、(TTC)7，经磷酸化、杂交后与接头 EP1/2、PB1/2 以 152(EP1/2重复
6、序列PB1/2)做酶连反应，酶连产物经 EcoR和 BamH双酶切后插入到克隆载体 pUC19 质粒中，转化进入大肠杆菌 DH5 株型，在含有氨苄的平板上筛选重组子3。按常规方法进行细菌的培养以及质粒的小量制备，Pvu酶切后电泳检测插入重复序列片段的大小。同时在接头中设计了 PleI 酶切位点，用 PleI 酶切重组质粒得到的小片段就是纯粹的插入序列。EcoR和 BamH 酶切重组质粒得到的片段就4是 25 bp 加上纯粹的插入序列。由此策略得到重复序列(GAA)28(TTC)28。1.2.2 自然遗传突变研究实验步骤用接种环挑取冻存菌体(GAA)28(TTC)28 在 LB 固体平板上划线，
7、恒温培养箱中 37 过夜培养以获得单菌落。用接种环挑取单菌落接入 8 mL 含氨苄青霉素(AMP)的 LB 液体培养基中，共 3 组，所加 AMP(100 mg/mL)的体积分别为为 30 L、35 L、40 L。每组 3 个平行实验，37 恒温培养振荡器培养，观察第一代菌体的生长情况。约 78 h 后用紫外分光光度计测得 OD650 为 0.6 左右，视为菌体生长的最佳状态。取 200 L 菌液加到 8 mL LB 液体培养基中，摇第二代菌，37 恒温培养振荡器培养，4 5 h 保存菌体。在同样条件下，用同样的方法传代培养得到第七代菌体。对第一、三、五、七代菌体提取质粒 DNA。为了检测菌体
8、在传代培养中 AMP 对遗传突变的影响，我们对第一代、第七代的部分质粒 DNA 进行 PCR 扩增检测，再用 5 %的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，结果见图 2。PCR 扩增：(1)模板：含有(GAA)28(TTC)28 的质粒DNA。(2)反应体系：采用 25 L 体系，buffer 加 2.5 L,Taq 聚合酶加 0.3 L，根据模板的浓度不同模板加入的量不同。体系中引物5EP1、PB2 的原初浓度分别为 1 908.8 ng/L、1645.5 ng/L，将其稀释 100 倍作为 PCR 扩增的引物，EP1、PB2 均加 4 L。dNPT为 25 mM 设定体系时 dNTP 加 3 L
9、。(3)反应程序：94 预变性2 min、94 变性 30 s、54 退火 30 s、72 延伸 40 s、72 延伸 5 min。本程序为 30 个循环。(4)电泳检测：5 %的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。2 结果与分析基因公司化学合成的寡核苷酸重复序列(GAA)7、(CTT)7 经磷酸化、再次磷酸化、杂交后插入到克隆载体 pUC19 质粒中，转化进入大肠杆菌 DH5 株型，在含有氨苄的平板上筛选重复序列的重组子。经过酶切鉴定后送往基因公司测序。TTC 重复了 28 次，由于测序只测一条链，同理推出另一条链 GAA 也重复了 28 次。见图 1。图 1 克隆重复序列(GAA)28.(TTC)28
10、 测序图 菌体的第一代与第七代相比，在 AMP 的体积为 30 L、 40 L 都有删除作用。从第一代和第七代菌体的质粒 DNA 的 PCR 产物可明显看出有比原重复序列短的序列的扩增产物存在，即 AMP 促进了重复序列的删除。见图 2。图 2 PCR 扩增产物 5 %聚丙烯酰胺凝胶电泳图 M：100 bp 的 Ladder Marker;1、3 、5、7 泳道：第一代菌体质粒 DNA 的PCR 产物;2、4、6、8 泳道：第七代菌体的质粒 DNA 的 PCR 产物;9、10 泳道：第一代和第七代菌体的质粒 DNA 的 PCR 产物;1-4 泳6道所加 AMP(100 mg/mL)的体积为 3
11、0 L，5-8 泳道所加AMP(100 mg/mL)的体积为 40 L3 讨论关于本实验中遗传突变的研究，菌体在 LB 液体培养基传代培养七代，在 100 mL LB 液体培养中加入 AMP(100 mg/mL)30 L、35 L、40 L 对重复序列的删除均有效果，证明该菌体存在遗传突变。【参考文献】1 Robert DW,Ruhee D,Micheal L,et al.Advances in mechanisms of genetic instability related to hereditary neurological diseasesJ.Nucleic Acids Research,2005,33(12)：3785-3798.2 Benjamin JL,Maryan B,Edward WC,et al.Structure and Dynamics in DNA Looped Domains:CAG Triplet Repeat SequenceDynamics Probed by 2-Aminopurine FluorescenceJ.Biochemistry,2007,46(38):10756-10766.3 毛爱华，赵秀娟，蔡禄. 与人遗传病相关 (CTG)n(CAG)7n 重复序列的分子克隆J.内蒙古大学学报， 2008,39(1):50-55.
