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1、1不同品系来源的骨髓间充质干细胞对小鼠肾缺血再灌注损伤作用的对比性研究作者：丁国永 郭丽 陈强 卢日峰 孟繁凯 凌翎 李鹏 范洪学【摘要 】 目的 探讨不同品系的骨髓间充质干细胞（BMSCs ）对各自小鼠肾缺血 再灌注损伤是否有促修复作用，为临床治疗肾脏疾病提供思路。方法 取健康 3 w 龄 C57BL/6J 小鼠和 ICR 小鼠的骨髓细胞悬液，进行 BMSCs 体外扩增培养。将 8 w 龄 C57BL/6J小鼠和 ICR 小鼠各随机分为假手术组、平行对照组和细胞移植组，每组 12 只小鼠。建立肾缺血 再灌注损伤模型，将 BMSCs 移植到细胞移植组小鼠中，平行对照组注射生理盐水。2 w 后，
2、检测肾功能和肾形态学变化，观察不同品系的 BMSCs 对各自小鼠肾缺血 再灌注损伤是否有促修复作用。结果 分离培养的 BMSCs 增殖旺盛，纯度较高，且均质性和稳定性好。BMSCs 移植 C57BL/6J 小鼠后，细胞移植组小鼠整体状态良好，与平行对照组相比肾功能指标明显改善（P0.05） ，组织形态学好转。而 BMSCs 移植 ICR 小鼠后，细胞移植组小鼠整体状态差，肾功能指标与平行对照组相比没有差异或者明显高于平行对照组（P0.05） ，肾病理性改变没有得到改观。结论 经尾静脉移植 BMSCs 后，可提高肾缺血 再灌注损伤后宿主 C57BL/6J 小鼠的恢复；但不能改善 ICR 小鼠肾缺
3、血 再灌注造成的损伤，甚至加剧了 ICR 小鼠肾损伤的程度。 2【关键词】 骨髓间充质干细胞；肾缺血 再灌注；修复【Abstract】 Objective To explore whether bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) from different strain mice can promote repairing renal ischemiareperfusion (I/R) injury and provide a method for the treatment of renal diseases. Methods BMSCs
4、were cultured and expanded from healthy 3weekold C57BL/6J mice and ICR mice in vitro, respectively. 8weekold C57BL/6J mice and ICR mice were randomly divided into sham, parallel control and cell transplantation groups, and 12 mice in each group. The renal I/R injury model was established. BMSCs were
5、 transplanted into cell transplantation group mice via the tail vein and saline was injected into parallel control group. Then, renal function, morphologic changes and renal pathology changes were detected after 2 weeks. The recovery of kidney of different strains mice were observed. Results BMSCs n
6、ot only had a high purification, homogeneity and stability, but also had unlimited proliferation. The 57BL/6J mice in transplantation group appeared the good state, and the indexes of renal function were significantly improved (P0.05),3the renal histomorphology became better. The ICR mice in transpl
7、antation group appeared the poor state, the indexes of renal function were not different from those in control group, and some indexes were significantly higher than those of control group (P0.05), the renal pathological changes were not improved. Conclusions The recovery of renal I/R injury in the
8、host is improved after transplantation of BMSCs into C57BL/6J mice by tail vain and renal injury is improved. But BMSCs can not improve ICR mice renal I/R injury, or even exacerbate the extent of renal injury.【Key words】 Bone marrow mesenchymal stem cells; Renal ischemiareperfusion; Repair干细胞研究几乎涉及生
9、命科学和生物医药的所有领域，其成果显著1 。肾脏是对缺血 再灌注损伤敏感的器官之一。休克、播散性血管内凝血、体外冲击波碎石术、肾脏外伤手术和肾脏移植均不可避免地发生肾缺血 再灌注损伤。肾缺血 再灌注损伤的主要病理变化是肾小管的损害，其可造成急性肾功能衰竭或导致肾移植失败。十年来，还没有明显有效的特殊疗法能改善肾缺血 再灌注损伤导致的急性肾衰竭。所以，寻找取材方便，易于扩增，能分化为肾小管上皮细胞，且具有可移植性和弱免疫性的材料成为研究热点。骨4髓间充质干细胞（BMSCs）取材容易，体外扩增力强，且在一定的条件下能向成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞和肝细胞等分化，在组织工程和细胞治疗中具有广阔的应用
10、前景2 。在国内外，也有学者研究观察到，间充质干细胞在刺激修复因子的作用下可向肾小管上皮细胞分化或者通过旁分泌的形式对局部缺血或再灌流造成的肾损伤具有保护作用，并改善肾脏的功能35 。这为细胞治疗肾缺血 再灌注损伤奠定了基础。考虑机体对细胞移植所表现的复杂的免疫反应，我们将不同品系的 BMSCs 移植到各自肾缺血 再灌注损伤的模型小鼠体内，从而观察不同品系的 BMSCs 对各自小鼠肾缺血 再灌注损伤是否有促修复作用。1 材料与方法1.1 动物与分组 吉林大学新民校区实验动物部提供的健康 3 w龄 C57BL/6J 小鼠和 ICR 小鼠各 3 只，用于提取 BMSCs。健康 8 w 龄雄性 C5
11、7BL/6J 小鼠和 ICR 小鼠各 36 只，体重 1822 g，随机分为假手术组、平行对照组和细胞移植组。1.2 实验试剂 低糖 DMEM 培养基（Gibco） ，胎牛血清（FBS，天津血液研究所） ，胰蛋白酶（宝泰克） ，Percoll（拜尔迪） ，尿素氮(BUN)和血肌酐(Cr)（南京建成） 。51.3 方法1.3.1 BMSCs 的培养 3 w 龄 C57BL/6J 和 ICR 小鼠脱臼处死，75%酒精消毒，取股骨，冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液，Percoll工作液分离，200 目滤网过滤成单细胞。以 1106/cm2 接种于培养瓶中，其培养体系为含 20% FBS DMEM 培养液
12、，37 5% CO2培养箱培养。1.3.2 建立肾缺血 再灌注损伤模型 将小鼠以 10%水和氯醛（30 mg/kg）腹腔麻醉，左肾区暴露肾脏以 4#手术线活结结扎左肾蒂。夹闭 30 min 后，松开活结，分层缝合。1.3.3 移植 BMSCs 再灌注 1 h 后从尾静脉处缓慢注入 0.2 ml的 1106/ml BMSCs 悬液，平行对照组注射 0.2 ml 的生理盐水。同时肌注青霉素（40 万 U/kg 体重） ，以防感染。1.3.4 各修复指标检测 2 w 后，取血测定小鼠肾功能（按试剂盒操作） ，取肾脏固定包埋，做肾组织切片并进行 HE 染色。1.4 统计学分析 肾功能指标用 xs 表示
13、，采用 SPSS13.0 统计软件进行分析，多组间的数据比较采用方差分析。62 结 果2.1 BMSCs 的培养 细胞接种 24 h 后可见少量细胞贴壁，贴壁细胞大部分呈圆形、短条形及多角形。3 4 d 后就可见一些细胞集落形成。78 d 后细胞集落迅速增多。910 d 后 80%90%长满培养瓶底部，融合成单层，细胞变得有长突起。多次传代后，BMSCs 呈均匀的长梭形生长，基本上无悬浮细胞。2.2 BMSCs 移植 2 w 后小鼠一般状况 2 w 后，平行对照组C57BL/6J 和 ICR 小鼠均精神萎靡，少动，状态一般。细胞移植组C57BL/6J 小鼠在外观体征和行为活动上与正常小鼠无异，
14、而细胞移植组 ICR 小鼠毛色粗糙、尿液发黄、进食明显减少、精神萎靡和少动，状态差。2.3 BMSCs 移植 2 w 后小鼠组织学变化 平行对照组 C57BL/6J和 ICR 小鼠左肾皮质肾小管结构几乎消失，有些细胞崩解，结构自溶，炎性细胞分布整个肾皮质；髓质部分可见肾小管的上皮细胞的数量大量减少，血管腔中可见大量炎性细胞浸润（图 1） ；细胞移植组 C57BL/6J 小鼠的左肾切片中，未发现明显的组织学改变（图 2） 。然而细胞移植组 ICR 小鼠左肾皮质的损伤更加严重，肾小球崩解，大量炎性细胞浸润，细胞的结构自溶，大量细胞死亡；髓质部分基本结构完全破坏，细胞发生自溶或消失，其病理损伤程度要
15、比平行对照组严重（图 3） 。7肾组织学变化 (HE,400)2.4 BMSCs 移植 2 w 后小鼠肾功能改变 BMSCs 移植 C57BL/6J 模型小鼠 2 w 后，平行对照组小鼠的血清 BUN 和 Cr 水平显著高于假手术组。细胞移植组小鼠的血清BUN 和 Cr 水平显著低于平行对照组（ P 0.05） ；细胞移植组与假手术组相比，无明显差异（P0.05） 。而移植 ICR 小鼠后，血清BUN 水平，细胞移植组高于平行对照组，但无统计学意义；血清Cr 水平，细胞移植组显著高于平行对照组（P0.05） （见表 1） 。表 1 C57BL/6J 和 ICR 小鼠血 BUN 和 Cr 水平变
16、化3 讨 论BMSCs 是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞。近年来，许多研究表明 BMSCs 具有极强的可塑性，已证实可分化为成熟的肝细胞、胆管上皮细胞、血管内皮细胞、神经元、神经胶质细胞、心肌细胞、肺泡上皮细胞等6 。BMSCs 形成于发育中的骨髓腔内，在原始的不具造血功能的骨髓中分裂旺盛。在具造血功能的骨髓中，BMSCs 是静止的，因此越是幼年动物的骨髓中，其 BMSCs 的含量越多。本研究提取 3 w 龄小鼠 BMSCs 的纯化率较高，其数量较多。Poulsom 等7将雄性小鼠骨髓细胞移植于经全身放射线照射8的雌性小鼠体内，结果受体小鼠肾组织的实质小管和肾小球足细胞中均发现了 Y 染色体阳性细胞，说明移植的 BMSCs 能归巢到受损伤的肾组织中。Kale 等8将骨髓干细胞经静脉移植到经全身放射线照射的缺血 再灌注损伤模型的大鼠中，发现骨髓干细胞有抑制肾损害进程的作用；而对照组无明显改善，则说明骨髓干细
