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1、1SORL1 基因多态性与散发性阿尔茨海默病关联分析作者：伍力 王燕 李超 伍星 余发春【摘要 】 目的 分析 SORL1 基因多态性与散发性阿尔茨海默病（SAD）是否存在关联。方法 采用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性（PCRRFLP ）技术，检测 114 例 SAD 患者及 111 例健康对照者的 SORL1 基因多态性分布特征。结果 SAD 组与对照组SORL1 基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义（21.693，P=0.429，2 0.965，P=0.326） 。不同性别的SAD 组与对照组 SORL1 基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义（男性：22.324，P=0.313
2、，2 1.667，P=0.197；女性：22.878，P=0.237，2 0.058，P=0.810） 。结论 亚洲汉族人群 SORL1 基因 rs641120 位点的 A/G SNP 多态性与 SAD 可能无关联。 【关键词】 阿尔茨海默病；基因表达；多态现象；遗传阿尔茨海默病（AD）是一种多因素引起的原发性退行性脑变性疾病，病因未明1 。AD 患者中，除少数为家族性外，绝大多数为散发性。散发性阿尔茨海默病（SAD）的发病是多个基因和环境因素共同作用的结果。目前，定位于 19 号染色体的载脂蛋白2E（APOE）4 等位基因作为 AD 的危险因子已得到广泛认同2 ，但 4 等位基因并非 AD
3、发病的充要条件3 ，其发病因素仅占了45%60%，由此可见尚有其他危险因素参与了 AD 的发病。研究发现遗传性或获得性的 SORL1 受体表达或功能改变，可能涉及 AD发生的机制4，5 。本研究通过对 SAD 患者 SORL1 基因进行多态性检测，探讨 SORL1 基因多态性与 SAD 是否存在关联。1 对象与方法1.1 对象114 例 SAD 患者为 2006 年 9 月至 2008 年 3 月在我院门诊及住院的患者，各患者间无亲缘关系，其中男 44 例，女 70 例，年龄 6385 岁，平均(75.16.1) 岁。均符合中国精神疾病分类方案与诊断标准第三版和美国精神障碍诊断和统计手册第 4
4、 版(DAM) 的AD 诊断标准6 。符合 MMSE 评分文盲患者17 分，小学文化患者20，中学及以上文化程度患者24 分。采用 Hachinski 缺血指数量表结合大脑影像学资料鉴别血管性痴呆和 AD，排除抑郁症所引起的假性痴呆，排除其他神经系统疾病、系统性疾病和物质中毒所致的痴呆，排除正处于心、血管、肺、肝、肾等重大躯体疾病急性期的患者。111 例健康对照老年人选自社区，满足 MMSE 评分文盲患者17 分，小学文化患者20，中学及以上文化程度患者243分。男性 41 例，女性 70 例，年龄 6287 岁，平均(73.66.3)岁。排除正处于心、血 管、肺、肝、肾等重大躯体疾病急性期的
5、患者。两组间的年龄、性别差异无统计学意义。1.2 方法1.2.1 位点SORL1 基因接近 5端的 rs641120 (A/G)SNP 多态性位点。1.2.2 引物上游引物：5CATGATCCAAATTATATGTGAAAAATTCAAT 3，错配引物设计，将 A 转换为 C，引入一个 Mun （Mfe）的酶切识别序列：CAATTG；下游引物：5CCCAAGAACATCAGGACACCAAC 3，扩增产物长度为：181 bp。1.2.3 PCR 反应条件95预变性 5 min，然后按 96 45 s，62 30 s，72 1 min，循环 35 次，末次循环后 72延伸 5 min，产物经含
6、EB 的 2%的4琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.4 SORL1 基因 rs641120 (A/G)SNP/MunI 限制性片段长度多态性(RFLP)分析 取 10 l 扩增产物，加入 8 个单位 Mun内切酶及其缓冲液，37消化 3 h。3% 的琼脂糖凝胶电泳，分离酶切产物片段。溴化乙啶染色后在紫外透射反射仪下分析电泳结果。1.2.5 验证结果各基因型随机抽取 5 例样本进行基因测序，验证酶切结果。x【摘要 】 目的 分析 SORL1 基因多态性与散发性阿尔茨海默病（SAD）是否存在关联。方法 采用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性（PCRRFLP ）技术，检测 114 例 SAD 患者及 11
7、1 例健康对照者的 SORL1 基因多态性分布特征。结果 SAD 组与对照组SORL1 基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义（21.693，P=0.429，2 0.965，P=0.326） 。不同性别的SAD 组与对照组 SORL1 基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义（男性：22.324，P=0.313，2 1.667，P=0.197；女性：22.878，P=0.237，2 0.058，P=0.810） 。结论 亚洲汉族人群 SORL1 基因 rs641120 位点的 A/G SNP 多态性与 SAD 可能无关联。 5【关键词】 阿尔茨海默病；基因表达；多态现象；遗传阿尔茨海默病（A
8、D）是一种多因素引起的原发性退行性脑变性疾病，病因未明1 。AD 患者中，除少数为家族性外，绝大多数为散发性。散发性阿尔茨海默病（SAD）的发病是多个基因和环境因素共同作用的结果。目前，定位于 19 号染色体的载脂蛋白E（APOE）4 等位基因作为 AD 的危险因子已得到广泛认同2 ，但 4 等位基因并非 AD 发病的充要条件3 ，其发病因素仅占了45%60%，由此可见尚有其他危险因素参与了 AD 的发病。研究发现遗传性或获得性的 SORL1 受体表达或功能改变，可能涉及 AD发生的机制4，5 。本研究通过对 SAD 患者 SORL1 基因进行多态性检测，探讨 SORL1 基因多态性与 SAD
9、 是否存在关联。1 对象与方法1.1 对象114 例 SAD 患者为 2006 年 9 月至 2008 年 3 月在我院门诊及住院的患者，各患者间无亲缘关系，其中男 44 例，女 70 例，年龄 6385 岁，平均(75.16.1) 岁。均符合中国精神疾病分类方案与诊断标准第三版和美国精神障碍诊断和统计手册第 4 版(DAM) 的6AD 诊断标准6 。符合 MMSE 评分文盲患者17 分，小学文化患者20，中学及以上文化程度患者24 分。采用 Hachinski 缺血指数量表结合大脑影像学资料鉴别血管性痴呆和 AD，排除抑郁症所引起的假性痴呆，排除其他神经系统疾病、系统性疾病和物质中毒所致的痴
10、呆，排除正处于心、血管、肺、肝、肾等重大躯体疾病急性期的患者。111 例健康对照老年人选自社区，满足 MMSE 评分文盲患者17 分，小学文化患者20，中学及以上文化程度患者24分。男性 41 例，女性 70 例，年龄 6287 岁，平均(73.66.3)岁。排除正处于心、血 管、肺、肝、肾等重大躯体疾病急性期的患者。两组间的年龄、性别差异无统计学意义。1.2 方法1.2.1 位点SORL1 基因接近 5端的 rs641120 (A/G)SNP 多态性位点。1.2.2 引物上游引物：5CATGATCCAAATTATATGTGAAAAATTCAAT 3，错配引物设计，将 A 转换为 C，引入一个
11、 Mun （Mfe）的酶切识别序列：CAATTG；下游引物：75CCCAAGAACATCAGGACACCAAC 3，扩增产物长度为：181 bp。1.2.3 PCR 反应条件95预变性 5 min，然后按 96 45 s，62 30 s，72 1 min，循环 35 次，末次循环后 72延伸 5 min，产物经含 EB 的 2%的琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.4 SORL1 基因 rs641120 (A/G)SNP/MunI 限制性片段长度多态性(RFLP)分析 取 10 l 扩增产物，加入 8 个单位 Mun内切酶及其缓冲液，37消化 3 h。3% 的琼脂糖凝胶电泳，分离酶切产物片段。溴化乙啶
12、染色后在紫外透射反射仪下分析电泳结果。1.2.5 验证结果各基因型随机抽取 5 例样本进行基因测序，验证酶切结果。1.3 统计学方法应用 SPSS13.0 统计软件。计量资料采用 t 检验；基因型分布和等位基因频率的两组间比较采用 2 检验；HardyWeinberg8遗传平衡判断采用 2 吻合度检验。2 结果2.1 SORL1 基因 rs641120 位点 A/G 多态性检测结果G 等位基因为 MunI 酶切识别位点，酶切结果显示共有三种基因型：GG 型，酶切后形成 153 和 28 bp 两个片段；AA 型，仅有 181 bp 一个片段；AG 型有 181、153 和 28 bp 三个片段
13、。见图 1。各基因型测序结果与酶切结果完全相符。2.2 AD 组与对照组 SORL1 基因型及等位基因频率比较经 2 吻合度检验 AD 组和对照组均符合 HardyWeinberg遗传平衡。AD 组与对照组 SORL1 基因型及等位基因频率分布见表1。经比较显示，两组间基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义。表 1 两组 SORL1 基因型及等位基因频率比较略2.3 不同性别的 AD 组与对照组 SORL1 基因型及等位基因频率比较不同性别的 AD 组与对照组 SORL1 基因型及等位基因频率9分布见表 2。经比较显示，不同性别的 AD 组与对照组基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义。表
14、 2 不同性别的 AD 组与对照组 SORL1 基因型及等位基因频率比较略3 讨论SORL1 受体为膜蛋白，属于低密度脂蛋白受体家族成员，穿梭于质膜、内涵体和高尔基体，在神经元细胞中发挥转运作用。SORL1 受体可以阻止 APP 形成 A，SORL1 受体表达减少将导致脑内高水平的 A，导致 AD 的发生。SORL1 受体由 SORL1 基因编码的，SORL1 基因位定于人类11 号染色体的长臂 q23.2q24.2 区域，长度为 177.49 kb，也称为 LR11 或 SORLA。 2007 年 Rogaeva 等5首先报道了 6 个不同种群的 SORL1 基因序列中的单核苷酸多态性（SN
15、P ）研究结果，关联分析表明 SORL1 基因的 SNP 与迟发性 AD 相关联，但也表现出不同种群的差异性，故推测 SORL1 变异可能增加神经退行性变的风险，机制可能与抑制基因的活性有关。在此之后，陆续有研究也证实 SORL1 基因的多态性与 AD 相关7，8, 但亦有部分研究显示无明显关联9， 10 。SORL1 基因的区域内存在多个位点的10SNP，各研究中位点选择的差异及各研究中研究样本的差异（如研究对象种群的差异，研究时诊断标准、纳入标准的差异） ，可能是各研究结果不一致的原因。本研究对 SORL1 基因 rs641120 位点的 A/G SNP 多态性分析结果显示，AD 组与对照
16、组该位点基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义，不同性别的 D 组与对照组该位点基因型及等位基因频率分布差异亦无统计学意义。该位点位于 5端的内含子中，Rogaeva 等5的研究显示，以色列阿拉伯人该位点与散发性AD 相关联，而北欧人中未发现此种关联。Joseph 等11对非裔美国人、加勒比西班牙人、北欧人的研究显示，未发现该位点的多态性与散发性 AD 相关联。本研究结果提示亚洲汉族人群，SORL1基因 rs641120 位点的 A/G SNP 多态性与散发性 AD 无关联。综上所述, 由于 SORL1 基因的其他区域存在多个位点的SNP，要了解该基因与散发性 AD 之间的关系，今后还应选择更多的位点进行更大规模
