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1、酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay,ELISA）一、基本原理：利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时，酶能高效、专一催化、分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的深、浅，可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的大小。该方法可对待测样品进行定性和定量分析，同时具有微量、特异、高效、经济、简便等优点，因此是一种广泛应用于生物和医学领域的微量测定技术。目前使用的酶联免疫检测方法很多，应用较多的有：间接法用于测定抗体双抗体夹心法主要用于测定大分子抗原竞争抑制法主
2、要用于测定小分子抗原二、试验材料及试剂酶标板（聚苯乙烯微量 96 孔板）包被液（0.05M pH9.6 碳酸盐冲液）无水 Na2CO3 1.59gNaHCO3 2.93g蒸馏水定容至 1000ml洗涤液（0.1M pH7.4 磷酸盐缓冲液）NaCl 8.0g KCL 0.2gKH2PO4 0.2gNa2HPO412H2O 2.9g吐温-20 0.5ml蒸馏水加至 1000 ml封闭液明胶 1g 包被液 100ml抗体稀释液明胶 0.1g洗涤液 100ml底物缓冲液（pH5.0 柠檬酸-磷酸缓冲液）0.1M 柠檬酸 (19.2g/L) 24.3ml 0.2M Na2HPO4 (28.4g/L)
3、25.7ml蒸馏水 50mlTMB 底物使用液TMB 储存液（100mg 溶于 10mlDMSO,40C 保存） 0.1ml底物缓冲液 10ml30%H2O2 10ul现用现配终止液（2M H 2SO4）H2SO4（ 96%） 22.2ml蒸馏水 177.8ml三、基本操作1、 间接 ELISA操作步骤如下：包被酶标板：加适度稀释的抗原，0.1ml/孔，4孵育过夜；洗涤：倾去孔内的液体，在吸水纸上拍干，加入洗涤液，0.3ml/孔，洗涤三次，3min/ 次；封闭：加入 1明胶，0.2ml/孔；37孵育 1h，洗涤同上待检血清：加入适当稀释度的待测血清，0.1ml/孔；37孵育 1h，洗涤同上酶标
4、记抗体：加入适当稀释度的酶标抗体，0.1ml/孔；37孵育 1h，洗涤同上底物：加入 TMD 底物使用液， 0.1ml/孔；37孵育 15min终止液：加入 2M H2SO4，0.1ml/孔；测定：终止后立即用酶标仪测定各孔 OD 450nm。2、 双抗体夹心 ELISA双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：包被酶标板：加适度稀释的抗体，0.1ml/孔，4孵育过夜；洗涤：倾去孔内的液体，在吸水纸上拍干，加入洗涤液，0.3ml/孔，洗涤三次，3min/ 次；封闭：加入 1明胶，0.2ml/孔；37孵育 1h，洗涤同上待检样品：加入适当稀释度的待测样品，0.1ml/孔；37孵育 1h，
5、洗涤同上酶标记抗体：加入适当稀释度的酶标抗体，0.1ml/孔；37孵育 1h，洗涤同上底物：加入 TMD 底物使用液， 0.1ml/孔；37孵育 15min终止液：加入 2M H2SO4，0.1ml/孔；测定：终止后立即用酶标仪测定各孔 OD 450nm。3、 竞争 ELISA（测抗体）操作步骤如下：包被酶标板：加适度稀释的抗原，0.1ml/孔，4孵育过夜；洗涤：倾去孔内的液体，在吸水纸上拍干，加入洗涤液，0.3ml/孔，洗涤三次，3min/ 次；封闭：加入 1明胶，0.2ml/孔；37孵育 1h，洗涤同上待检血清：加入适当稀释度的待测血清与标准血清的混合物，0.1ml/孔；37孵育 1h，洗
6、涤同上酶标记抗体：加入适当稀释度的酶标抗体（可特异性的与标准血清反应，不与待测血清反应）0.1ml/孔；37孵育 1h，洗涤同上底物：加入 TMD 底物使用液， 0.1ml/孔；37孵育 15min终止液：加入 2M H2SO4，0.1ml/孔；测定：终止后立即用酶标仪测定各孔 OD 450nm。四、结果判定在间接法和夹心法 ELSIA 中，阳性孔显色深于阴性孔。在竞争法 ELISA 中则相反，阴性孔显色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下：1、间接法和夹心法：a. 以 P/N 值表示：每批试验都需要阳性和阴性对照，求出样品的 OD 值与一组阴性样本吸收值的比值，即为 P/N 值，
7、若比值大于 2.1，则判为阳性。b. 以 x+2SD 表示：若样品的 OD 吸收值阴性样本的平均吸收值+2 标准差，则判为阳性。c. 以滴度表示：将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本显色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。2、竞争法：用抑制率表示抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度，按下式计算：抑制率（%）= （阴性对照 A 值-标本 A 值）100%/阴性对照 A 值一般规定抑制率50%为阳性，50%为阴性。注意事项（1） 酶标板的选择：目前常用的是 96 孔聚苯乙烯酶标板。不管何种载
8、体，在使用前均需进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。（2） 包被抗体(或抗原)的选择：包被用抗体(或抗原) ，要求纯度要好,吸附时一般要求 PH在 9.09.6 之间。另外还要考虑吸附温度，时间及其蛋白量对试验的影响,一般多采用 41824 小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0 和 10gml 等) 进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD 值。选择 OD 值在 1 左右而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为110gml。（3） 洗涤： ELSIA 就是靠洗涤来达到分离
9、游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。所以在 ELISA 操作中，洗涤是很重要的关键步骤，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。通常是洗涤 3 次，每次 3min，如果试验结果本底较高，可适当增加洗涤次数或延长洗涤时间。洗涤时在吸水纸上轻拍 35 次，将反应孔中的液体尽量拍干，动作不易过猛。洗涤液不要加的过满，如溢出可能造成孔间污染。（4） 加样：加样时应将所加物加在 ELISA 板
10、孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加样时用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸头，以免发生交叉污染。加酶标二抗和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成，以免加样时间延误造成不必要的操作误差。在 ELISA 试验中，加样量通常为 0.1ml/孔，封闭液可适量增加，如 0.2ml/孔，这样可使反应孔侧壁也被封闭，减少非特异性吸附。（5） 试验标本的保存：血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以 HRP 为标记的 ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污
11、染，菌体中可能含有内源性 HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法 ELISA中可使本底加深。一般说来，在 5 天内测定的血清标本可放置于 4，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作。（6） 显色：显色液一定要先现用现配，以免过期的显色液影响试验结果。（7） 孵育：ELISA 的实质就是抗原、抗体反应，所以试验的温度一般控制在 37，即抗原抗体结合最适温度。多块反应板同时操作时，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。（8） 每次试验，都要分别设阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。
