《苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系研究（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系研究【摘要】 目的 探讨苏云金芽孢杆菌（Bt)与蜡状芽孢杆菌（Bc）的亲缘关系,为 Bt 鉴定、安全性评价及降低其致病风险等提供科学依据。方法 采用肠杆菌基因间重复一致序列-PCR（ERIC-PCR）技术，对 6 株苏云金芽孢杆菌和 3 株蜡状芽孢杆菌及对照菌株的基因组DNA 进行扩增，对其指纹图谱进行分析；回收并克隆重复性好的苏云金芽孢杆菌基因组 DNA 扩增片段，以其为探针，分别与供试菌株基因组 DNA 进行杂交。结果 与蜡状芽孢杆菌相比，苏云金芽孢杆菌菌株间基因组 DNA 指纹图谱较一致；所有供试苏云
2、金芽孢杆菌菌株均扩增产生一条 250bp 左右的片段；苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌均可扩增产生 600bp 左右的共有 DNA 片段。此外，以苏云金芽孢杆菌 500bp 片段为探针与苏云金芽孢杆菌基因组 DNA 杂交有很好的特异性。结论 肠杆菌基因间重复一致序列-PCR 指纹图谱可以正确反映苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系；500bp 片段可以作为苏云金芽孢杆菌鉴定探针。 【关键词】 苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis,Bt)与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus,Bc)同属于蜡状芽孢杆菌菌群，为自然界中广泛精品文档欢迎来主页查询更多精品文
3、档,欢迎来我主页查询分布的革兰阳性菌1 。其中 Bt 在其休眠期可形成对昆虫有毒性的伴胞晶体。因此，被作为生物杀虫剂广泛应用于农业及卫生害虫的生物防治；Bc 则是人畜条件致病菌，可导致人食物中毒和感染，引起呕吐和腹泻2 。研究表明，在自然环境中，两者染色体体外遗传物质可以出现高度重组3 ，在 DNA 水平也具有较高的同源性，只有个别碱基有差异4 。由于 Bt 与 Bc 的相似性，许多细菌分类学家认为 Bt 与 Bc 应为同一个种5 。Bt 和 Bc 间的同源性关系，使 Bt 安全性问题越来越受到人们重视。因此，为研究两者的亲缘关系，对 Bt 的鉴定、Bt 应用的安全性评价，以及进一步提高 Bt
4、 杀虫效力、降低其致病风险，本文利用肠杆菌基因间重复一致序列（ERIC）PCR 技术6对 Bt 和 Bc 全基因组 DNA 进行扩增，对获得的 Bt 和 Bc 基因组 DNA 指纹图谱进行分析，探讨 Bt 和 Bc 起源进化关系，同时筛选并克隆了 Bt 基因组 DNA 扩增片段，对应用 ERIC-PCR 技术鉴别、鉴定 Bt 和 Bc 进行可行性探讨。结果报告如下。1 材料与方法11 材料精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询111 菌株 Bt 6 株（菌株号为 CGMCC 11749 、CGMCC 11754 、CGMCC 1294 、CGMCC 1905 、CGMCC 198
5、9 、CGMCC 11014 ） ，Bc 标准株 1 株（菌株号为 CGMCC 1126 ） ，大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等对照菌株各 1 株（菌株号分别为CGMCC 190 、CGMCC 1933 和 CGMCC 189 ） 购于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC) ，Bc 分离株 2 株为沈阳出入境检验检疫局分离,并经国标生化鉴定。112 PCR 引物及试剂 (1)ERIC 引物: 由大连 TaKaRa 生物工程有限公司合成，引物序列分别为： Primer：5-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3，Primer：5-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG
6、-3；（2）试剂：Ex-Taq 酶、IPTG、X-gal（大连 TaKaRa 生物工程有限公司） ；pGEMT vector 连接转化试剂盒（pGEM-T vectorSystem ）及 JM109 高效率感受态细胞（美国 Promega 公司） ；放射性同位素-32P-dCTP 和随机引物DNA 标记试剂盒（Random Primer DNA Labeling System，英国Biolabs 公司） ；尼龙膜及 3MM 滤纸（英国 Whatman 公司） ；其他试剂为本实验室自配，均为分析纯。12 方法精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询121 菌株培养及其基因组 DNA
7、的提取 斜面活化的菌株在 LB 培养基中 30摇床培养过液(200r/min) ,离心收集 2ml 培养的菌体(4000r/min ,10min ,20) ,采用实验室常规酚/氯仿法提取各菌株基因组 DNA。所提取 DNA 经 Beckman DU640 检测，吸光度A260/A280 值在 18 19 之间，纯度符合 PCR 扩增条件。122 ERIC-PCR 反应条件及结果鉴定 (1)反应体系组成和反应条件:依据文献方法7 。PCR 产物进行 15 琼脂糖凝胶电泳（U3V/cm；T100min） 。DNA 标准分子量为 DL2000，PCR 产物经溴化乙锭(EB)染色后在凝胶成像系统上照相
8、。123 PCR 产物回收与克隆 将上述扩增产物利用 15% 琼脂糖凝胶电泳分离。选取重复性好的 Bt 基因组 DNA 扩增片段，使用 DNA凝胶回收试剂盒进行回收、纯化。纯化产物连于 pGEM-T 载体，转入JM109 感受态大肠埃希菌。连接反应、转化操作以及克隆子的鉴定按照常规方法进行；阳性克隆子用 NaOH/SDS 碱裂解法制备质粒DNA。精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询124 斑点杂交 按照随机引物 DNA 标记试剂盒（Random Primer DNA Labeling System）说明标记回收产物，以标记产物为探针，分别与供试菌株基因组 DNA 进行杂交。12
9、5 引物设计及 PCR 验证 发生特异性杂交反应的克隆片段由大连 TaKaRa 生物工程有限公司进行测序。利用 Primer Premier 50 软件8,根据特异克隆片段序列信息设计引物，序列分别为:Bth：5CGAGCAGTAGGCGAACCATTG-3Bth:5TGGCATGGGCTTTCGGATATT-3 。引物对应的扩增产物长度为 363bp；PCR 反应条件：94预变性 2min；9430s，5530s，7230s，共 30 循环；72延伸 5min。体系同 ERICPCR 。以6 株 Bt 及其他对照菌株的染色体 DNA 作为模板，进行 PCR 反应。2 结果21 ERIC-PC
10、R 图谱（图 1） 6 株苏云金芽孢杆菌和 3 株腊状芽孢杆菌的基因组 DNA 经 ERIC-PCR 扩增，均可产生清晰的 DNA 指纹图谱，扩增片段范围 1002500bp，各菌株扩增图谱的多态性程度不同。Bt 基因组 DNA 指纹图谱较一致，由 3 条主带构成，所有供试 Bt精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询菌株均有 1 条 250bp 左右的扩增片段，而蜡状芽孢杆菌间 DNA 指纹图谱变异较大。另外，Bt 和 Bc 均可扩增得到 600bp 左右的共有片段。1：CGMCC 11749 ； 2：CGMCC 11754 ； 3：CGMCC 1294 4：CGMCC 1905
11、 ； 5：CGMCC 1989 ； 6：CGMCC 11846 7：CGMCC 1126 ； 8,9：Bc 分离株 B：negative control-no DNA M：DL2000图 1 Bt、Bc 基因组 DNA ERICPCR 结果指纹图谱（略）22 斑点杂交（图 2） 纯化、克隆指纹图谱中稳定出现的 Bt DNA 扩增片段，经 DU-640 测定浓度约为 90g/L，以其为探针对固定于膜上的供试菌株基因组 DNA 进行斑点杂交。结果显示，以500bp 片段为探针，与苏云金芽孢杆菌杂交结果为阳性，枯草芽孢杆菌及属外的各菌株杂交结果为阴性。上一页 1 2 下一页23 PCR 验证（图 3
12、） 根据特异克隆片段序列设计的 Bth和Bth引物对，可以从 Bt 菌的基因组 DNA 中扩增出约 360bp 的片段，精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询符合预期结果；而所有对照菌株均没有扩增条带，表明此特异片段来源于 Bt 菌基因组 DNA。16：Bt 菌株；7,8,9：Bc 菌株；10：枯草芽孢杆菌；11：大肠埃希菌；12：金黄色葡萄球菌图 2 500bp 探针对各菌株杂交放射性自显影 15d 照片（略）16：Bt 菌株；7,8：Bc 菌株； 9：大肠埃希菌图 3 引物 Bth和 Bth对 Bt 菌及对照菌 DNA 的扩增结果（略）3 讨论根据本研究得到的 Bt 指纹图谱
13、的保守性和 Bc 指纹图谱的变异性可以推测出，Bt 在进化过程中出现较晚，这与 Carlson 等的 Bt 可能是获得携有 cry 基因质粒的 Bc 变种的观点相符9 。从本实验的扩增图谱中还可看出,Bt 亚种 tolworthi HD125 与其他 Bt 菌株的主精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询带型一致，这一结果与 Carlson 和 Kolsto 关于肠毒素基因阴性 Bt菌株起源的观点一致，即 Bc 获得 cry 基因后，进化为肠毒素基因阳性 Bt 菌株，然后失去该基因进化为肠毒素基因阴性 Bt 菌株10 。另外，Bt 与 Bc 均可扩增产生 600bp 左右的共有 D
14、NA 片段，体现了二者在遗传上的高度同源性。因此，ERIC 指纹图谱可以正确反映出Bt 与 Bc 的亲缘关系。由于 Bt 和 Bc 间的同源性关系，Bt 安全性问题越来越受到人们重视11，12 。本研究筛选到的 500bp 片段可作为苏云金芽孢杆菌的鉴定用探针。【参考文献】1 David A Rasko,Michael R Altherr,Cliff S Han,et al.Genomics of the bacillus cereus group of organismsJ.FEMS Microbiology Reviews,2005,29:303-329.2 Lund T,Granum P
15、 E,Sullivan K O.The sequence of the non-haemolytic enterotoxin operon from bacillus cereusJ.FEMS Microbiol Lett,1999,178:355-361.精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询3 袁志明，蔡全信， Andrup L，et al.苏云金芽胞杆菌肠毒素基因的 PCR 检测J.微生物学报，2001，41（2）:148-154.4 M C te Giffel,R R Beumer,N Klijn,et al.Discrimination between bacillus
16、 cereus and bacillus thuringiensis using specific DNA probes based on variable regions of 16S rRNAJ.FEMS Microbiology Letters,1997,146:47-51.5 Sergei G Bavykin,Yuri P Lysov,Vladimir Zakhariev,et al.Use of 16S rRNA,23S rRNA and gyrB gene sequence analysis to determine phylo-genetic relationships of bacillus cereus gr
