《芪芩Ⅰ号对小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎的防治作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《芪芩Ⅰ号对小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎的防治作用（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询芪芩号对小鼠柯萨奇 B3病毒性心肌炎的防治作用【关键词】 病毒性心肌炎 【Abstract】 AIM: To explore the inhibitive effect of Qiqin on Coxsackie virus B3(CVB3), and its preventive and therapeutic effect on CVB3 viral myocarditis (VMC) in mice. METHODS: The microdose cytopathogenic effect inhibition assay was us
2、ed in Hep2 cell culture to investigate the way through which Qiqininhibited the virus. BALB/c mice were infected by CVB3 and then randomly divided into control group and Qiqin group. The mice were sacrificed on different days and the myocardial pathological scores were estimated. RESULTS: The effect
3、ive and nontoxic concentration of Qiqin was 2.88 g/L and 1.44 g/L respectively. Qiqin directly inactivated CVB3 and inhibited the replication of CVB3 in cultured cells. Qiqin also protected cells from viral infection. Compared with the infected control group, the myocardial pathological scores in Qi
4、qin group significantly decreased (P 0.01). CONCLUSION: In addition to inhibiting CVB3 in vitro, Qiqin also has obvious therapeutic effect on CVB3 viral myocarditis in vivo in mice. 【Keywords】 Coxsackievirus B3; viral myocarditis; 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询Qiqin 【摘要】 目的：探讨复方制剂芪芩号(Qiqin)水煎剂对柯萨奇病毒 B3(
5、CVB3)的抑制作用和对小鼠 CVB3病毒性心肌炎的防治作用. 方法：在 Hep2细胞上采用微量细胞病变抑制法，从直接灭活病毒、抑制细胞内病毒复制、阻断病毒吸附三方面研究芪芩号对CVB3的抑制作用. 采用 BALB/c鼠建立 CVB3病毒性心肌炎的动物模型，建立病毒对照组和芪芩号组，然后在不同时间点处死小鼠，记录其心肌组织病变积分. 结果：芪芩号水煎剂对细胞无毒且效应明显的原生药浓度是 2.88 g/L和 1.44 g/L. 芪芩号可能具有直接灭活 CVB3、抑制细胞内 CVB3复制、阻断 CVB3吸附细胞的作用. 芪芩号组小鼠的心肌病变积分明显低于病毒对照组，二者比较有显著差异（P 0.01
6、）. 结论：体外实验证实芪芩号可能对 CVB3有抑制作用，动物实验进一步证明芪芩号在体内对小鼠CVB3病毒性心肌炎有良好的防治作用. 【关键词】 柯萨奇病毒 B3；病毒性心肌炎；芪芩号 0引言 病毒性心肌炎（viral myocarditis, VMC）是小儿常见的临床疾病，其治疗一直是临床工作者非常关注的问题1，2. VMC的发病机制尚未完全阐明，目前多认为早期主要是病毒直接侵犯心肌，后期则以病毒持续感染和免疫损害为主. 在 VMC的发生发展中病毒感染是一个重要的环节，柯萨奇 B3病毒（Coxsakievirus 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询B3，CVB3）是主要病原
7、体之一，目前尚缺乏针对 CVB3有效的抗病毒药物. 近年来，大量研究证实，中药在抗 CVB3上具有一定的优势. 芪芩号(Qiqin)是我们经过反复研究筛选出的一个组方，由黄芪、黄芩等几味中药组成，具有清热解毒、益气养阴、活血化瘀的功效. 我们旨在研究芪芩号对小鼠 CVB3VMC的防治作用及其抗 CVB3的作用. 1材料和方法 1.1材料 柯萨奇病毒 B3Nancy株(本实验中心提供). 采用 ReedMuench微量法滴定病毒效价为 104TCID50. -30保存待用. Hep2细胞（本实验中心提供）在 24孔培养板上于 37，50 mL/L CO2条件下(以下培养条件同此）用含 20 g/
8、L小牛血清的 RPMI 1640培养基传代培养,生长良好形成单层后用于实验. 清洁级近交系 BALB/c雄性小鼠，70只，68 wk龄，体质量 1820 g，由第四军医大学实验动物中心提供. 将小鼠随机分成 3组,即病毒对照组、芪芩号组各 30只；正常对照组 10只. 以黄芪、黄芩等中药组成的复方中药芪芩号，制成生药含量为 368 g/L的水煎剂；药液过滤、分装、0.1 kPa高压灭菌，4保存备用. 1.2方法 1.2.1体外细胞病变抑制实验 1.2.1.1芪芩号对 Hep2细胞毒性的测定将制备好的药液用RPMI 1640维持液进行倍比稀释，原生药物浓度分别是精品文档欢迎来主页查询更多精品文档
9、,欢迎来我主页查询184，2.88，1.44，0.72 g/L. 在 Hep2细胞孔中分别加入各稀释度药液 1 mL，每个稀释度设 4孔，并设正常细胞对照，培养 3 d，每日观察细胞病变情况. 测最大无毒稀释液浓度后，以此浓度为起始之后的 4个稀释度用于下一步实验. 1.2.1.2芪芩号直接灭活 CVB3的作用将上述 4个稀释浓度的药液分别与等体积的 100 TCID50的 CVB3病毒液混合，37作用 3 h后,接种于 24孔培养板的单层 Hep2细胞上，置 37培养箱 1 h后换为 RPMI 1640维持液，继续培养. 每一个浓度设 4孔. 同时设立正常细胞、37存放 3 h的病毒对照各
10、4孔. 定时观察细胞病变（CPE） ，待正常细胞生长正常，病毒对照 CPE达时判定结果. 1.2.1.3芪芩号抑制细胞内 CVB3复制的作用去掉细胞孔中的生长液，将等量的 100 TCID50的 CVB3病毒液接种于单层 Hep2细胞上，吸附 1 h后换成等量的不同浓度药液，继续培养. 每一个浓度设 4孔. 同时设立正常细胞、病毒对照孔各 4孔. 观察同上. 1.2.1.4芪芩号阻断 CVB3吸附细胞的作用去掉细胞孔中的生长液，将等量的不同浓度的药液加入单层 Hep2细胞上，培养 3 h，弃去药液，加入 100 TCID50 CVB3病毒液，于 37，50 mL/L CO2作用 1 h，换为
11、RPMI 1640维持液，继续培养. 每一个浓度设 4孔. 同时设立正常细胞、病毒对照孔各 4孔. 观察同上. 1.2.1.5CPE程度判定标准：细胞无病变；+：细胞病变 25以下；：细胞病变 2550；：细胞病变 51%75；：细胞病变75以上. 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询1.2.2动物实验 1.2.2.1VMC动物模型的复制及给药芪芩号组和病毒对照组小鼠经腹腔接种含 500 TCID50的 CVB3病毒液 0.1 mL；正常对照组小鼠经腹腔接种维持液 RPMI 1640，0.1 mL. 接种 1 h后,开始灌胃给药. 按小鼠和人的体表面积换算法计算出小鼠芪芩号的用
12、量为生药 0.19 g/kg. 芪芩号组给予芪芩号药液，病毒对照组和正常对照组给等量的生理盐水，连续 21 d. 1.2.2.2动物处死及标本的收集各组分别于病毒感染后第3，5，7，10，14 和 21日断颈处死存活小鼠 3只，获取心脏，置于40 g/L多聚甲醛固定，行常规病理切片，HE 染色，光镜观察结果. 1.2.2.3组织病理学检查采用 Rezkalla半定量分析法3 ，光镜下计量心肌炎症、坏死面积,即每张切片取 5个高倍视野，计算每个视野中炎性细胞浸润及坏死区域面积与整个视野的面积之比，无病变计 0分、 25%计 1分、25%50%计 2分、51%75%计 3分、 75%计4分. 统计
13、学处理: 计量资料用 xs表示,采用方差分析进行统计分析. 计数资料以率表示. 2结果 2.1体外细胞病变抑制实验 2.1.1芪芩号对细胞的毒性实验用不同浓度的药液直接作用于Hep2细胞，培养 24 h，大于 1128（2.88 g/L）的浓度对细胞有明显的毒性,细胞死亡. 1128 以下浓度的药液，对细胞的毒性消精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询失，培养 72 h也未出现细胞死亡的毒性反应. 2.1.2芪芩号对 CVB3的作用观察 30 h时，病毒对照组的 CPE达（） ，正常对照细胞正常生长. 芪芩号药液浓度为 2.88 g/L和1.44 g/L时，直接灭活 CVB3和抑
14、制细胞内 CVB3复制的两个试验中，病毒攻击细胞后 30 h药物组 CPE为阴性(-), 而阻断 CVB3吸附细胞试验中,病毒攻击细胞后 30 h药物组 CPE为阳性(+). 2.2动物实验 2.2.1小鼠死亡情况正常对照组无死亡. 病毒对照组在病毒攻击后第 5日开始出现死亡，共死亡 13只（43）. 芪芩号组开始出现死亡时间为第 8日，比对照组推迟 3 d，共死亡 5只（17）. 死亡高峰时间在 710 d，各组小鼠在 10 d后未再发生死亡. 2.2.2心肌组织病理学检查病毒对照组和芪芩号组的病理积分及统计结果见 Tab 1. 由此得出：芪芩号组小鼠的心肌病变在各时间点均轻于病毒对照组.
15、病毒对照和芪芩号组小鼠感染后第 3日出现心肌细胞水肿，第 5日开始有炎细胞浸润. 第 7日心肌组织可见大量炎细胞浸润并伴有点片状坏死. 第 710 日，病变最重. 第 14日以后炎性细胞浸润和心肌坏死逐渐减少. 正常对照组心肌无病变，光镜下病理积分为 0.表 1VMC小鼠心肌组织病变积分（略） 上一页 1 2下一页3讨论 CVB为一组单链 RNA病毒,属肠道病毒属，可引起人类一系列疾精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询病，如呼吸道感染、非细菌性脑膜炎、心肌炎等. 对临床符合心肌炎心肌病诊断标准的患者，不论急性期、慢性期或扩张型心肌病，其外周血白细胞中均可检测到 CVBRNA4.
16、 Li等5在心肌炎心肌病患者的心肌中检出病毒 RNA及衣壳蛋白 VP1，支持肠道病毒感染是扩张性心肌病的发病机制. 因此病毒性心肌炎治疗的关键是清除心肌细胞内感染的病毒. 但目前尚无有效的治疗药物，国内在常规治疗基础上加用中药方面也作了很多研究6-8 ，取得一定的成绩. 从中草药中开发研制新型有效的抗病毒药物是一条重要途径. 我们的实验表明芪芩号在体外有抗 CVB3的作用. 芪芩号药液的有效浓度为 2.88 g/L和 1.44 g/L，药液直接作用于 CVB3后，病毒的感染力明显减弱，攻击细胞后 30 h所产生的 CPE为阴性,表明芪芩号可能具有直接灭活 CVB3的作用. 先用病毒攻击细胞，使病毒进入细胞后，再加入芪芩号药液，有以上两个浓度的芪芩号药液保护的细胞则不产生 CPE,故推测芪芩号可进入细胞内起作用，抑制细胞内 CVB3的基因复制
