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1、草莓脱毒方法以药剂处理加茎尖培养可增加脱毒效果,如盐酸四环素对草莓的四种病毒都有一定的抑制作用。覃兰英等(1988)将草莓在 35下热处理 7 d 后,逐步升温至 38,在湿度 40%68% 、光照度 4 0005 000 Lx 条件下热处理 35 d 后,将长出的新茎茎尖再行组培,可获得 100%的脱毒苗。大泽胜次(1982)在进行单倍体育种时发现花培植株的脱毒率达 100%。此法不仅可快速繁殖出大量无毒植株,还可省去病毒鉴定工作,在育种与生产应用上可谓一举两得。利用花药培养脱毒苗,其成功与否与花蕾大小的选择有关,应选取处于密封状态的小花蕾,此时的花粉发育期为单核靠边期。花蕾的大小与不同的品
2、种有一定的差异。高庄玉等(1993)用草莓花药组培,其脱毒率达 100%，用幼叶和茎尖产生的愈伤组织其再生植株脱毒率只有 20%。艾勇、赵佐敏等(2000)用 1/2MS+0.1 mg/L IBA+琼脂 4.57 g/L+白糖 20 g/L 诱导丰香草莓试管苗生根,生根率可达 100%。移栽时不用任何基质处理,采取试管苗一次性入土移栽(适温 2025,1 周内保持空气湿度在 95%以上),幼苗成活率可达 85%,花药培养草莓花药培养是获得无毒苗的途径之一，其优点是操作简单，并能大量繁殖。薜光荣等经花药愈伤组织直接分化出花药植株的途径培育出沙尔普斯等 5 个品种的脱毒苗，脱毒苗在生长、结果、可溶
3、性固形物含量等方面均超过对照株，果实总产和平均果重均大幅度提高。这表明，实现草莓的无病毒栽培，将会给草莓生产带来很大的经济效益。花药愈伤组织的诱导和再分化培养过程，以添加 2 mg/L 的 6-BA 和 0.21.0 mg/L 的NAA 为宜；茎尖分化培养过程中添加 6-BA 的浓度为 0.51.0 mg/L；继代分化快繁过程中,6-BA 浓度一定要掌控好，要求 6-BA 的浓度在 0.51.0 mg/L 范围内不断变换调节，3 周左右继代快繁一次,这样苗子在整个继代快繁过程中才能保持生长健壮、分化系数高(达到810 倍) 、无褐化现象发生等。反之，如果 6-BA 浓度过高 (2 mg/L)时
4、,苗子会出现脆化、黄化、过密、矮化等现象；过低(025 mg/L)时，苗子会出现细弱、弯曲、过高、生根过多等现象，均不利于苗子的分化快繁。生根培养中添加 6-BA 浓度以 025 mg/L 为最好，苗子生长粗壮、根系发达,发根率为 100%。将花药接种到 1 号培养基（MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.1 mg/L+3%蔗糖）上，1 周后花药陆续形成愈伤组织，达 78.6%；1 个月左右转接愈伤组织到 2 号培养基（MS+6BA 1 mg/L+NAA 0.l mg/L+3%蔗糖）上。注意观察，当芽长到 lmm 左右时转接到 3 号培养基（MS 十 6-BA 1mg/L+3%蔗塘）上，逐渐
5、形成芽丛， 1 个月后，把芽丛分开成单芽再分别转接到新的 3 号培养荃上，让花继续分化生长;以后根据情况每隔 1030 天转接一次 .这样，年内每个分化组织可获得 500020000 裸苗.从培养基中取出草毒苗，洗去培养基后移栽到温室，浇透水，加塑料罩;l2 周内保持湿度95%一 100%半月后打开塑料罩.23 个月后移栽到大田栽培.分化培养基:MS+BA0.250.5mg/L,糖 30g/L，琼脂 6g/L。每两周可获 1525 倍分化苗,然后转移到生根培养基上。生根培养基:MS+IBA(IAA)0.11mg/L,糖 30g/L,琼脂 6g/L,加入活性炭 0.3g/L,增大光照，1 个月左
6、右可获得 87.5%100%的生根率。草莓茎尖组织培养草莓茎尖培养的目的有三：一是在短期内加速繁殖草莓优良品种以供商品化生产；二是挽救严重感染病毒的草莓优良品种；三是结合辐射诱变进行草莓品种的改良和选育。草莓的茎尖培养始于 20 世纪 60 年代。通过茎尖培养可脱除植物病毒。国内覃兰英等试验表明，茎尖培养有不同程度的脱病毒作用，茎尖越小，去掉病毒的机会越大。热处理后取茎分生组织培养，脱病毒的效果明显增加，经电镜观察鉴定证明其脱毒效果更为可靠。外植体选择：选择无病虫、品种纯正的健壮植株,栽于盆中,置人工气候箱内 40处理 16 h、35处理 8 h、变温处理 4 周。在新生嫩枝上,切取带生长点的
7、茎段 34 cm 为外植体,用流水冲洗干净。茎尖剥离将表面清洗过的外植体置于超净工作台上,用 70%酒精表面消毒30 s,再用 0.1%升汞消毒 510min 并不断搅动,然后用无菌水冲洗 35 次,去鳞片。在解剖镜下用针挑取茎尖 0.20.3mm（带 12 个叶原基） ，立即接种于茎尖分化培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+IAA 0.05mg/L+蔗糖 3% )中。培养条件草莓茎尖培养需温度为 2328,光照强度 10003000 lx,光照 1216 h/d。诱导培养 23 个月,待丛生芽形成后转入增殖培养基。快速增殖：选取生长正常的试管苗,在增殖培养基(MS+BA 10mg/L+N
8、AA 004mg/L+蔗糖 3% )上进行增殖。增殖培养每 2030 d 继代 1 次,总继代次数不超过 10 次。诱导生根：选高 23 cm 的小苗转入生根培养基(MS+BA 1.0 mg/L+蔗糖 3% ),经过 2030 d 的生根培养,可形成完整植株的组培苗。不合格的试管苗全部销毁。炼苗：将生根后的试管苗移栽到经过消毒的苗床或装有消毒基质的穴盘,置网纱(孔径042mm)覆盖的网室中,在温度 l525、相对湿度 85% 90%条件下进行炼苗。初期适当遮阳,后期逐渐通风和增加光照, 23 周后移栽苗成活。用指示植物检测法进行草毒斑驳病毒、草毒皱缩病毒、草毒镶脉病毒和草莓轻黄边病毒的检测。未
9、检测出病毒的样本,即为原原种苗,可用于原种苗的繁殖。原种苗的繁殖：将脱毒原原种苗定植于无土壤线虫、无草莓病源和防虫隔离区内,分株繁殖的第 1 代植株即为脱毒原种苗,可用于生产用苗的繁殖。脱毒原种苗要接受病毒检测机构的定期病毒检测,要求病毒感染率不超过 5%,一旦发现问题立即更换。脱毒生产用苗繁殖：将脱毒原种苗定植于无土壤线虫、无草莓病源和防虫隔离区内,分株繁殖后代即为脱毒生产用苗。脱毒生产用苗直接用于草莓生产。脱毒生产用苗需接受病毒检测机构的定期病毒检测,要求病毒感染率不超过 20%。体细胞突变体筛选近年来，日本领导的研究小组正致力于筛选草莓抗真菌枯萎病的抗病突变体研究。他们首先建立了叶片再生
10、植株的实验体系，以病原真菌为选择筛选抗性愈伤并诱导成株，将这些再生植株栽培于含病原菌的土壤中，同时人工接种病原胞子液来鉴定植株的抗病性，他们从 1225 株再生植株中得到两个抗病体细胞无性系。这个结果表明，开展抗性突变体筛选研究有可能在短期内定向选择得到抗病、抗逆或抗除草剂的草莓新品种（系） 。草莓的基因转化20 世纪 80 年代末，国外一些实验室就开展了草莓的基因转化研究。利用草莓愈伤组织培养再生系统，分别成功地完成从农杆菌介导的基因转化。还建立了由草莓叶盘直接再生不定芽的技术。近年来，由于草莓原生质体再生成株技术的发展，利用原生质体直接吸收外源的草莓基因转化途径的研究也有了长足的进展。芽诱
11、导培养基为 MS+BA 1.0 mg/L，培养温度为 25,湿度 70%80%,光照强度约 2 000Lx,光周期为 15h/9h。每 34 周更换一次培养基。观察结果并记录。继代培养：接种 23 个月左右,当生长点发育成 1cm 左右的芽团时,将其转移到继代培养基进行快繁培养。继代培养基以 MS+BA 0.5mg/L 为主,根据芽的生长繁殖状态以及不同阶段的不同需求,适时对 BA 的浓度进行调整,其他培养条件同上。继代培养时,分割的芽团含 45个芽。每 3 周左右更换一次培养基。诱导生根：生根前的最后一次继代培养将 BA 的浓度降低到 0.2mg/L 进行壮苗。尽量选取健壮的无根幼苗接种到生
12、根培养基中诱导生根。生根培养基为 MS+BA0.1mg/L+活性碳1.0g/L。移栽驯化：当根系长至 23cm 时,将生根幼苗连瓶一并转移到驯化室内进行练苗 7d 左右。方法:将培养瓶去掉封口膜后集中到一起 ,加盖小拱棚及 50%遮阳网,注意保持拱棚内的温度及湿度,每天在保证幼苗不萎蔫的前提下逐渐加大小拱棚的放风量。待幼苗逐渐适应驯化室的温度和湿度后,把幼苗从瓶中拿出来,小心洗去根部的培养基,注意不要伤到根,按大小分级后移栽到移植盘中。移栽基质为草碳土农家肥=11 或蛭石农家肥=11。待长出 5 片左右新叶时,采用小叶嫁接法用 UC-5 指示植物鉴定其脱毒效果。草莓试管苗移栽基质以全蛭石效果最
13、好，成活率平均为 98.33，株高及发根数、总根长等几项指标也较为理想。珍珠岩不宜作为草墓试管苗移栽的主要基质，因为幼苗生长黄弱，株高及总根长等项指标均不理想。草莓采果后的管理：1 去衰老叶、病叶 草莓采果后要及时去除地上部的衰老叶及病叶，减少或避免营养无效消耗，集中养分供给母株生长。2 去匍匐茎 采果后，每隔 20 d 左右去匍匐茎 1 次，连去 34 次，以减少养分消耗，集中养分供给母株，促其花芽分化，利于翌年多结果。3 肥水管理 在 8 月上旬至 9 月上旬，追施复合肥 2025 kg/667m2，并叶面喷洒 0.2% 的磷酸二氢钾溶液 23 次，以促进植株健壮生长和花芽分化。采果后要减
14、少浇水次数和浇水量，防止匍匐茎旺长。4 中耕培土：采果后应及时中耕培土，将土向植株根部堆起，培土高度以露出苗心为宜。组织培养技术 1培养程序和培养基 5-6 月于晴天的下午在健壮、无病的草莓刚抽出的匍匐茎上取茎尖，大小为 03-04mm，作为组织培养的外植体。 用于草莓茎尖培养诱导芽分化的基本培养基为 MS，附加 6-BA05mg/L，NAA02mg/L，蔗糖 30g/L，琼脂粉 65gL，pH 值调至 58-60。 在草莓茎尖的扩大繁殖阶段，采用 MS 培养基附加 6-BA05mg/L、NAA0 01mg/L。扩大繁殖主要是将丛生苗分块即每 5-7 株切成一块，转入继代培养基。在转苗过程中，
15、去掉原生叶片有利于新苗分化，在扩大繁殖中随时清除愈伤组织，有利于新苗增殖和生长。 诱导生根培养基用 12MS 附加不同浓度 IBA。试验表明：以 IBA01mg/L 的浓度处理的生根率最高，为 100，平均根条数为 24 条。不加 IBA 及 IBA 浓度超过02mg/L，多数苗都是先于苗基切口处产生愈伤组织，随后在愈伤组织上分化生根，致使成活率大大降低。 2操作技术要点及培养条件 (1)灭菌与接种 预处理 为了灭菌彻底，常把接种材料先进行湿润处理，使灭菌剂能顺利地渗入材料。可用多种湿润剂，我们采用的是 75的酒精，湿润的时间为半分钟至 1 分钟。 灭菌处理 在草莓组织培养中常用灭菌剂的种类很
16、多。我们曾用过次氯酸钠 10水溶液(含有效氯 04-0 5 )，浸泡接种材料 10-15 分钟；次氯酸钙 (漂白粉)，用其饱和上清液，浸泡接种材料 15-30 分钟；过氧化氢 10-12水溶液浸泡 10-20 分钟；新洁尔灭 5-10水溶液，浸泡 10-15 分钟；升汞 01水溶液，浸泡 8-10 分钟。其中前 4 种灭菌剂对接种材料比较安全，但因灭菌时间较长，常常使接种材料的外层氧化变褐，以致影响培养效果。升汞有很强的杀菌能力，但浸泡时间稍长会造成接种材料中毒。因此，在草莓组织培养中，如把握好时间，升汞是应用较多的灭菌剂。灭菌后的接种材料，要用无菌水充分清洗，通常要换水 3-5 次。 接种 以培养无病毒苗为主要目的的草莓组织培养，所接种的茎尖材料很小，在接种时首先要求准确熟练地剥取茎尖生长点，并使用固体培养基比较适宜，接种时
