《IL21调节免疫平衡对大肠癌细胞生长的抑制作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《IL21调节免疫平衡对大肠癌细胞生长的抑制作用（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1IL21 调节免疫平衡对大肠癌细胞生长的抑制作用作者：张振亚 张伟 陈学谦 安广权 单保恩 于跃明【摘要 】 目的 观察大肠癌患者和接种 Colon26 细胞小鼠的Th1/Th2 平衡偏移情况，同时以 IL21 调整小鼠 Th1/Th2 平衡，观察调节细胞免疫平衡对大肠癌的影响。方法 随机选取 30 例大肠癌患者，采用流式细胞仪测定 Th1/Th2 细胞比值及血清中 IFN和 IL4 浓度。另于小鼠爪垫内侧皮下接种高分泌 IL21 的Colon26/IL21 细胞，对比观察小鼠肿瘤生长情况及对机体免疫平衡状态的影响。结果 30 例大肠癌患者和 30 例正常人 Th1/Th2比值分别为 0.7
2、40.27 和 1.260.9；血清 IFN 浓度的测定值分别为（6.261.43）和（9.182.31）pg/ml；IL4 浓度的测定值分别为（8.881.30）和（5.201.71）pg/ml；IFN/IL4 比值的测定值分别为 0.700.10 和 1.820.35，两者差异明显。接种Colon26/IL21 细胞组小鼠肿瘤持续生长至 16 d 后逐渐缩小，小鼠血清中 IFN 浓度明显高于对照组；接种 Colon26 细胞组小鼠肿瘤持续生长增大，血清中 IL4 浓度高于 Colon26/IL21 细胞组；免疫平衡向细胞免疫方向转变。结论 大肠癌患者与正常人相比细胞免疫功能下降，免疫平衡（
3、Th1/Th2 平衡）向 Th2 型偏移；IL21可以增强 Th1 型细胞免疫功能，调节 Th1/Th2 细胞比例，纠正免疫失衡，有效发挥杀灭肿瘤细胞。 2【关键词】 免疫平衡；IL21 ；大肠癌； Colon26 细胞恶性肿瘤的发生发展常与机体的免疫功能低下有关，调节肿瘤患者机体免疫平衡，增强其细胞免疫功能有助于改善治疗效果。白介素 21（IL21 ）主要由活化的 CD4+T 细胞分泌的型细胞因子，能够促进 T 细胞、NK 细胞、树突细胞的增殖、分化并能提高NK 细胞的杀伤活性，加强机体细胞免疫功能。本研究旨在通过流式细胞学和 ELISA 方法对比观察大肠癌患者与正常人之间免疫功能的差异；并
4、通过调节机体分泌 IL21 水平，观察免疫平衡状态的变化以及抑制肿瘤生长的作用。1 资料与方法1.1 临床实验标本的采集随机选取本院院外科经病理证实的住院结肠癌患者 30 例，其中男 17 例，女 13 例，年龄 2974 岁，中位年龄为 61 岁，病例排除标准：无应用任何免疫制剂；肠梗阻合并白细胞升高；无合并其他部位感染；伴乙型肝炎、类风湿关节炎、甲状腺功能亢进等与免疫相关的疾病；对照组 30 例均为健康人，男 17 例，女 13 例，年龄 2870 岁，中位年龄为 63 岁，与大肠癌患者在性3别、职业、年龄等方面均具有可比性（P0.05） 。标本采集均为空腹静脉血。血标本分成两部分：A 用
5、促凝管采血 1 ml，1 500 r/min 离心 10 min，提取血清，80 保存备用； B 用 EDTAK2抗凝的无菌试管采血 1 ml，采血后即刻送实验室进行实验。1.2 实验动物、细胞株清洁级 Balb/c 雌性小鼠共 90 只，体重 25 g 左右,均购自河北医科大学实验动物中心（合格证编号：701147） 。小鼠结肠低分化腺癌 Colon26 细胞株、转染 IL21 基因的 Colon26 细胞株（Colon26/IL21 细胞）由本院科研中心单保恩教授惠赠。1.3 主要仪器及试剂EpicsXL 型流式细胞仪，NU400400E 超净工作台，倒置显微镜，高速低温离心机，CHIBI
6、TAN 型微量离心机，凝胶成像分析系统 ，UV2201 型紫外分光光度计，DFCII 型电泳仪，80 超低温冰箱，PCR 扩增仪，酶联免疫检测仪。人IFN、IL4 、小鼠 IFN、IL4 定量 ELISA 试剂盒由晶美生物工程有限公司（北京）提供；FITC 标记的抗 CD4 单抗（CD4FITC ） 、PE 标记的抗 IL4 单抗（IL4PE ） 、PE 标记的抗 IFN 单抗（IFNPE ） 、佛波醇乙酯、离子霉素、蛋白转运抑制剂由美国4BD 公司提供；0.1%Triton X100 由美国 Sigma 公司提供；RPMI1640 培养基由 Gibco 公司提供；Trizol 由 Invit
7、rogen 生物技术公司提供；RTPCR 酶混合物由华美生物工程公司提供；小鼠IL21 基因上、下游引物由华美生物工程公司合成，上游引物为5GAGGACCCTTGTCTGTCTGG3 ，下游引物为5TCATCTTTTGAAGGAGCCATTT3 ；DNA Marker 由北京鼎国生物公司提供。1.4 结肠癌患者外周血 Th1、Th2 细胞检测取患者抗凝血 1 ml，以 PMA、离子霉素为刺激原，加蛋白转运抑制剂后培养，裂解红细胞后洗涤后弃上清，CD4FITC 单抗标记洗涤，加 4%多聚甲醛固定， 0.1%Triton X100 缓冲液破膜加入 IFNPE、IL4PE ，室温孵育,充分洗涤后用
8、PBS2%多聚甲醛悬浮细胞，应用 EpicsXL 型流式细胞仪进行检测，激发光源为 15 mW 氩离子激光器，激发波长为 488 nm,应用Expo32ADC 进行免疫荧光分析。将 CD4+IFN+ T 细胞认为Th1 细胞、 CD4+IL4+ T 细胞认为 Th2 细胞，Th1/Th2 比值代表机体的免疫平衡状态。同法检测对照组外周血 Th1、Th2 细胞和Th1/Th2 细胞比值。1.5 酶联免疫吸附法检测 IFN、IL4 血清浓度5严格按照说明书进行操作。1.6 Colon26/IL21 细胞株 IL21 基因的表达测定取生长旺盛的 Colon26/IL21 细胞，加入 Trizol 溶
9、液裂解细胞，加入氯仿振荡后静置。低温离心后取无色上层水相，加入 0.5 ml 异丙醇混匀静置，加入 75%乙醇，得到总 RNA（同法提取Colon26 细胞总 RNA） 。用紫外分光光度计测定 RNA 的 OD260 nm、 OD280 nm 数值。求出 OD260 nm/OD280 nm 比值以鉴定RNA 纯度。分别取 Colon26/IL21 及 Colon26 细胞总 RNA，于琼脂糖凝胶中电泳，分析 RNA 完整性。分别以提取的Colon26/IL21 细胞及 Colon26 细胞总 RNA 为模板，依次 RNA 1.5 l、上游引物 0.9 l、下游引物 0.9 l,酶反应混合物 2
10、 l、MgCl2 1.0 l、dNTP 1.2 l。置 PCR 扩增仪扩增 IL21 DNA。反应条件为：cDNA 第一链合成 37 50 min；灭活反转录酶 94 5 min；然后进行下列循环：变性 94 45 s，复性 66 45 s，延伸 72 30 s，循环数 25；再延长 72 5 min。将Colon26/IL21 细胞及 Colon26 细胞 RTPCR 扩增产物作电泳，观察各细胞株 IL21 表达的情况。1.7 Colon26 和 Colon26/IL21 细胞接种后肿瘤生长情况对6比取 90 只 Balb/c 小鼠，随机分为 3 组，每组 30 只，分别为Colon26 组
11、、Colon26/IL21 组和空白对照组。Colon26 组和Colon26/IL21 组分别于小鼠爪垫内侧皮下接种 Colon26 细胞Colon26/IL21 细胞悬液 0.04 ml（5105 个细胞） ；空白对照组同部位注射生理盐水 0.04 ml。观察爪垫肿瘤生长情况，每隔 48 h测量并记录肿瘤体积（肿瘤体积的计算公式为 1/2长宽 2） 。将小鼠爪垫每次肿瘤体积观测值取平均值，绘出爪垫肿瘤体积变化曲线。于接种第 24 天时取血 1 ml 后处死，完整剥离肿瘤，称重测量Colon26 组和 Colon26/IL21 组小鼠爪垫肿瘤重量。肿瘤组织用10%中性甲醛固定，HE 染色观察
12、接种肿瘤组织细胞学差异。1.8 统计学方法应用 SPSS13.0 软件进行两样本间的 t 检验和单因素方差分析。2 结果2.1 外周血 Th1、Th2 细胞及 Th1/ Th2 比值的测定7测定 30 例结肠癌患者和 30 例正常人的 Th1 细胞数目无明显差异；结肠癌患者 Th2 细胞比例升高，导致机体 Th1/ Th2 平衡向 Th2 型偏移。见图 1。结肠癌患者 IFN 的测定值较正常人明显降低，IL4 的测定值则显著升高， IFN/IL4 比值有显著差异（P0.01） ，说明大肠癌患者较正常人细胞免疫力下降、免疫平衡向 Th2 型偏移。见表 1。表 1 两组患者外周血中 Th1、Th2
13、 细胞、IFN、IL4 检测及免疫平衡状态比较(略)2.2 Colon26/IL21 细胞株基因表达测定Colon26/IL21 细胞经 RTPCR 扩增所得产物在 434 bp 附近形成特异性条带，说明 Colon26/IL21 细胞株有 IL21 mRNA稳定表达。见图 2。2.3 接种 Colon26 小鼠和 Colon26/IL21 小鼠肿瘤生长情况测定小鼠接种 Colon26、Colon26/IL21 细胞后于爪垫均逐渐形成肿瘤。接种 Colon26 细胞组肿瘤持续增大，接种Colon26/IL21 细胞组肿瘤于 16 d 达到平均体积 1.3 mm3，然后逐渐缩小，两组肿瘤体积变化
14、曲线。见图 3。24 d 时处死小鼠后两组肿瘤称重结果，两组肿瘤平均重量分别为（2.480.31） ，（0.270.10）g ，差异显著（ P0.01） 。82.4 Colon26 细胞和 Colon26/IL21 肿瘤组织病理学观察接种 Colon26 细胞小鼠爪垫肿瘤组织镜下可见组织间质少，细胞排列无规律，部分组织细胞出现坏死。细胞核体积增大，胞浆与细胞核比例较正常增大，核大小不一，形态不规则，多染色深，可见病理性核分裂像，呈恶性肿瘤生长。接种 Colon26/IL21 细胞小鼠的肿瘤组织可见肿瘤细胞核固缩、核溶解，胞浆空泡变性；肿瘤组织萎缩，间质纤维组织增生，出现部分正常皮下组织，如皮脂
15、腺、毛囊等，是肿瘤萎缩、消退的表现。见图 4。2.5 接种 Colon26 小鼠和接种 Colon26/IL21 小鼠免疫状态情况测定接种 Colon26 细胞小鼠较正常小鼠细胞免疫力下降，免疫平衡向 Th2 型偏移；接种 Colon26/IL21 细胞小鼠增强了 Th1 型细胞的免疫功能，使免疫平衡状态转向 Th1 型，纠正了肿瘤造成的免疫平衡偏移，有效抑制了肿瘤细胞的生长。见表 2。表 2 接种不同种类细胞小鼠各组间 IFN、IL4 及 IFN/IL4 检测比较(略)3 讨论9近年发现改善肿瘤患者免疫功能可以增强对恶性肿瘤的治疗正常情况下机体处于动态的免疫平衡状态，Th1 细胞主要介导细胞免疫，通过分泌细胞因子，调节机体获得性免疫。恶性肿瘤患者的Th 细胞亚群发生向 Th2 的漂移，机体细胞免疫受到抑制，使肿瘤逃避免疫监视。我们用流式细胞计法测定了结肠癌患者外周血Th1、Th2 细胞分布情况，发现与正常组相比 Th2 细胞数目增加、Th1/Th2 细胞数目比例下调、免疫平衡向 Th2 型偏移，机体不能有效杀灭肿瘤细胞，致使肿瘤不断生长，甚至发生远处转移。Onishi等1研究发现肾细胞癌患者的 Th2 类细胞及相应因子多高于正常平均值，同时发现 Th2 类细胞因子含量与肿瘤的恶性程度呈正相关。维持机体的细胞免疫功能不仅依靠 Th1 型细胞数目，并且其相应细胞因子的活化作
