《HBV-HEV融合二价抗原原核表达载体的构建及蛋白的初步表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《HBV-HEV融合二价抗原原核表达载体的构建及蛋白的初步表达（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1HBV/HEV 融合二价抗原原核表达载体的构建及蛋白的初步表达作者：何秀霞, 于源华*, 张春兰, 荀恒杰【摘要 】 目的: 构建一个能够表达出乙/ 戊型肝炎二价抗原的重组原核表达载体, 并在 E.coli BL21(DE3)中表达。方法: 采用 PCR方法扩增出 HBV 的 S 基因和 HEV 的 ORF2 编码区的羧基末端中的414 606 aa 的基因片段, 将两片段连接后克隆入 T 载体, 得到融合基因, 将融合基因克隆入含有 增强子的 pTTE 高效的原核表达载体中, 构建重组质粒 pTT7SE。 将 pTT7SE 转化 E.coli BL21(DE3), 经 IPTG 诱导后用
2、Western blot 鉴定融合蛋白。结果: 获得全长为 1 284 bp 的融合的 HBV/HEV 的基因片段。已构建的重组质粒 pTT7SE 转化 E.coli BL21(DE3)后, 经 IPTG 诱导, 表达出相对分子质量（Mr）约为 50 000 重组蛋白。SDSPAGE 分析显示, 表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于胞质中, 表达量约占全菌蛋白的 30.52%。Western blot 结果表明在 Mr 为 50 000处可见特异性着色带。结论: 成功构建了原核表达载体 pTT7SE, 并表达出目的蛋白, 为研制预防乙型和戊型肝炎双价疫苗提供了实验技术基础。 【关键词】 H
3、BV HEV 重组原核表达载体 二价疫苗2乙型肝炎（HBV）是危害全球人类健康最重要的传染病之一, 它除能够诱发急性或慢性肝炎外, 还与人的肝硬化和肝癌等死亡率极高的疾病有直接的关系1,2。世界卫生组织估计 2000 年全球慢性 HBV 携带者达 4 亿人 3,4, 其中有可能发展为肝细胞癌。而戊型肝炎（HEV）病毒是戊型病毒性肝炎的病原体 , 主要经消化道传播, 常通过饮用被 HEV 污染的水源而引起爆发性流行 , 主要累及一些发展中国家, 散发性病例呈全球性分布。HEV 对 HBV 的复制无影响, 但 HEV 感染会加重乙肝患者肝脏损害和临床症状, 并可推测 HEV对乙型肝炎发展有促进作用
4、5。HBV 的基因组位于衣壳内 , 为 3.2 kb 的不完全双链的开环DNA, 基因组共有 4 个公认的开放读框, 分别为编码包膜蛋白HBsAg 的 s 区, 编码衣壳的核心区(C 区, HBcAg), 编码病毒聚合酶的 P 区 , 以及编码 X 抗原(HBxAg) 的 X 区。克隆 HBSAg 基因, 将其转入酵母中表达, 表达产物进行加工处理即成为目前广泛使用的基因工程疫苗6。而最早的戊型肝炎病毒重组研究是用大肠杆菌表达的。1992 年 Purdy 等7将缅甸株 HEV ORF2 的 3端大约三分之二基因片段插入 pATH10, 在大肠杆菌中表达融合蛋白 trpEC2。经Werstern
5、 blot 分析证明 , trpEC2 具有很好的抗原性和广泛性。但目前即可以抗乙肝又可以抗戊肝的疫苗尚没有研究。为此本课题组展开此项研究, 将 HBV/HEV 的融合基因 SE, 克隆入融和表达载体3pTTE 中, 转化大肠杆菌 BL21, 以期表达出融合蛋白。为进一步研究其免疫保护效果及制备抗乙肝和戊肝的双价 DNA 疫苗奠定了基础。1 材料和方法1.1 材料 T 载体 pTA2（从鼎国公司购买）; pTTEE 质粒（由厦门大学提供）; 大肠杆菌 DH5 及 BL21（DE3 ）; pADR1质粒由由南京军区军事医学研究所朱进博士惠赠。乙肝和戊肝患者阳性血清及阴性对照血清来自于吉林省长春市
6、肝胆病医院, 辣根过氧化物酶标记的兔抗人 IgG 购自 Sigma 公司。 TaKaRa Ex Taq 酶, T4 DNA 连接酶, EcoR I 酶, Xho I 酶, Nde I 酶（从宝生物公司购买）; 胰蛋白胨, 酵母提取物, IPTG, 甘油, DTT, Bis, Acr, Aps, 琼脂糖, 琼脂, 低 Mr 标准蛋白: marker DL 15 000; DNA/EcoR I 和 Hind III; TEMED, 硝酸纤维素膜, Tris 等（从鼎国公司购买） ; 蛋白转印PVDF 膜（购自 Millipore 公司）; Western blot 化学发光检测试剂盒（SuperS
7、ignal West Pico Trail Kit） （购自 Pierce 公司）; Xray 底片（购自 Kodak 公司）; DYCZ24D 双垂直电泳槽（北京六一仪器厂）; VE186 转移电泳槽（上海天能科技有限公司） 。1.2 方法41.2.1 目的基因的获取 PCR 扩增乙型肝炎 adr 亚型的 S 基因8。上游引物 F1: 5CGGAATTCATGGAGAACACAAC3（GAATTC 为 EcoR I 酶切位点） 。下游引物 F2: 5CGCTCGAGTCAAATGTATACC3（CTCGAG 为 Xho I 酶切位点, 去除终止密码子） 。由于上下游引物之间存在引物二聚体,
8、所以在 PCR 反应体系中, 先加上游引物, 设计程序为 95, 4 min。95, 30 s; 57, 45 s; 72, 50 s, 循环 10 次, 72, 10 min。而后再加下游引物 , 再进行 95, 4 min。95, 30 s; 57, 45 s; 72, 50 s, 循环 25 次, 72, 10 min。戊型肝炎ChinaD（GenBank No: D11092.1）亚型的基因序列, 以质粒pTTEE 为模板进行 ORF2 编码区的羧基末端中的 414606 aa的基因片段的 PCR 扩增。上游引物 P1: 5CCATATGACATCTGTAGAGAATGCTCAG3（C
9、ATATG 为Nde I 酶切位点 , 去除启始密码子）下游引物 P2: 5GAATTCGCGCGGAGGGGGGGC3（GAATTC 为 EcoR I 酶切位点, 去除终止密码子） 。PCR 反应的设计程序为 95, 4 min; 94, 30 s; 68, 50 s; 72, 50 s, 循环 35 次, 72, 5 min。分别取 PCR 回收产物与 pTA2 载体连接, 命名为 pTA2S、 pTA2E, 转化后挑取阳性克隆进行 PCR 及酶切鉴定并测序。1.2.2 pTT7SE 重组质粒的构建 分别回收由 EcoR I/Xho 5I 双酶切 pTA2S 和 EcoR I/Nde I
10、双酶切 pTA2E 的目的片段, 各取5 L 与 pTTE 原核表达载体质粒用限制性内切酶 Xho I 和 Nde I 消化后回收的产物进行连接。将连接产物转化 E.coli DH5 感受态细胞。PCR 鉴定 pTT7SE 重组质粒。1.2.3 pTT7SE 重组质粒的 Southern blot 鉴定 为了进一步鉴定 pTT7SE 构建正确 , 以其作为模板, 用随机引物法标记的pADR1 质粒上的 S 基因的 PCR 产物和 pTTEE 为模板进行ORF2 编码区的羧基末端中的 414606 aa 的基因片段的 PCR 产物做探针, 采用 DIG High Prime DNA Labeli
11、ng and Detection Kit II(ROCHE)进行 Southern blot 检测。1.2.4 融合蛋白的原核表达 将鉴定正确的重组质粒pTT7SE 转化表达菌 BL21(DE3), 过夜培养, 挑取单克隆在 LB 培养基(含有 80 mg/L 的卡那霉素, 15 g/L 的葡萄糖)中 37, 240 r/min 振荡培养过夜。再按 150 转接到新的含有氨苄青霉素的 LB 培养基中, 37 震荡培养至 A600 为 0.4 时, 加入终浓度为 1 mmol/L IPTG 进行诱导表达, 18培养 20 h。在 4 以 6 000 r/min 离心 10 min, 收集菌体,
12、冻于-20保存待用。为了提高对目的蛋白的检测效率, 在 SDS 上样缓冲液中加入终浓度为 8 mol/L 的尿素, 以增加对包涵体的溶解能力。进行（浓缩胶 40 g/L, 分离胶120 g/L） SDSPAGE 凝胶电泳, 光密度扫描检测目的蛋白相对含6量和大小。1.2.5 融合蛋白的 Western blot 检测 取适量纯化的表达的重组蛋白进行 SDSPAGE 电泳, 电泳完毕后, 进行转膜, 设置电压30 V, 电流 50 mA, 电转 3 h 后, 将膜取出, 置于封闭液中（含有100 mL/L 小牛血清的 PBS pH7.4）, 4过夜, 用 0.5 mL/L 的PBST 洗涤 3
13、次, 每次 10 min, 将用同样方法转的两张膜分别与11 000 稀释的乙肝和戊肝病人血清为一抗共同孵育 1 h, 同前洗涤, 将膜与 110 000 兔抗人 HRP 酶标二抗共同孵育 1 h, 同前洗涤后, 膜用吸水纸吸干, 置于干净器皿中, 将 SuperSignal West Pico Trail Kit (Pierce)中的发光底物取出, 分别吸取 0.5 mL 的 A 液和 B 液, 混匀加到 PVDF 膜上, 作用 35 min, 小心置于暗盒中, 在暗室中安全灯下, 打开底片暗盒, 将 Xray 底片置于膜上, 曝光时间为 10 s, 之后将曝光好的 Xray 底片置于显影液
14、中 , 显影 13 min, 然后用清水洗净后, 再放入定影液中 3 min, 拍照记录结果。2 结果2.1 目的基因的获得 采用 PCR 方法分别对乙型肝炎和戊型肝炎相关基因进行扩增, 并与 pTA2 载体连接, 得到连接产物pTA2S、 pTA2E。pTA2S 质粒用 EcoR I/Xho I 酶切鉴定, 得到693 bp 的片段, 其大小与 GenBank 提供的乙型肝炎 adr 亚型的相7应区域大小一致。pTA2E 质粒用 Nde I/EcoR I 酶切鉴定, 得到 591 bp 的片段, 其大小与 GenBank 提供的戊型肝炎 ChinaD 亚型的基因的相应区域大小一致(图 1）
15、。分别对其进行测序, 经序列比对, 表明目的基因得到了正确的克隆。图 1 pTA2E 和 pTA2S 的双酶切鉴定（略）1: pTA2E 的 EcoR I/Nde I 酶切产物; 2: DNA marker DNA/EcoR I 和 Hind III; 3: pTA2S 的 EcoR I/Xho I 酶切产物; 4: 质粒 pTA2E; 5: 质粒 pTA2S.2.2 pTT7SE 原核表达重组质粒的鉴定 以戊型肝炎病毒部分 ORF2 基因的上游引物 P1 和乙型肝炎病毒 S 基因的下游引物 F2对 pTT7SE 表达载体进行 PCR 扩增得到 1 284 bp 的产物（图2）, PCR 鉴定结果说明乙型肝炎 adr 亚型的 S 基因和戊型肝炎ChinaD 亚型的 ORF2 的部分基因序列已经正确连接到 pTTE表达载体上, pTT7SE 表达载体的构建已经完成。图 2 pTT7SE 载体的 PCR 鉴定（略）1: DNA marker(DL 15 000); 2, 3: 以戊型肝炎病毒部分ORF2 基因的上游引物和乙型肝炎病毒 S 基因的下游引物进行 PCR扩增得到的产物.82.3 pTT7SE 重组质粒的 Southern blot 鉴定 以pTT7SE 作为模板 , pADR1 质粒上的 S 基因的 PCR 产物和pTTEE 为模板进行 ORF2 编码区的羧基末端中的 41
