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1、Western Blot试剂的准备1. 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr） 29.0g亚甲双丙烯酰胺（Bis） 1.0g混匀后 ddH2O，37溶解，定容至 100ml，棕色瓶存于室温。2. 4分离胶缓冲液（1mol/L Tris-HCl PH 8.8） Tris 18.17g 加 ddH2O溶解，浓盐酸调 PH 8.8，定容至 100ml。3. 4浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-HCl PH 6. 8） Tris 12.1g 加 ddH2O溶解，浓盐酸调 PH 6. 8，定容至 100ml。4. 10%SDS：电泳级 SDS 10.0g加 ddH2O，68助溶，浓盐酸调 PH 7
2、.2，定容至 100ml。5. 5电泳缓冲液（PH 8.3）： Tris 15.2g甘氨酸 94g ddH2O 定容到 1000mlSDS 5g先在 974ml蒸馏水中加入 Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加 SDS。6. 10%过硫酸铵（AP）：0.1g AP 加 ddH2O至 1.0ml，4保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。7. 2加样缓冲液：2SDS 加样缓冲液0.5mol/L Tris-HCl (PH 6.8) 2ml10%SDS 4 ml-巯基乙醇 1ml甘油 2ml1%溴芬蓝 1ml置 4避光保存8. TEMED：注意室温较低时 TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用9.
3、 转膜缓冲液(Towbin transfer Buffer)：即 1SDS-PAGE10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) ： NaCl 8.5g(12H2O)Na2HPO4 2.9011g(2H2O)NH2PO4 0.24g加 ddH2O定容至 1000ml11. 封闭液: 1PBS 中加入 30ml5%（V/V）脱脂奶粉 1.5g0.02%叠氮钠 0.006g0.05%Tween-20 0.015g12. 漂洗液（PBST）：含 0.05% Tween-20的 PBS溶液每 1000 ml PBS溶液中加 0.5 ml Tween-2013. 水饱和正丁醇：正丁醇 50 m
4、lddH2O 5 ml 加入瓶中震荡，使结合，存于室温。用时取上面一相加在凝胶上面。14. 考马斯亮蓝染色法试剂：一般用 G250考马斯亮蓝（蛋白定量专用）染色液： 90 ml 甲醇：水（1：1，V/V）和 10 ml冰乙酸的混合液中溶解 G250马斯亮蓝0.25g，用 Whatman 1号滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。（染色液多次回收利用）脱色液：90 ml 甲醇：水（1：1，V/V）和 10 ml冰乙酸的混合液15. 丽春红 S染色色法试剂：2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液脱色液：TBS16. Aprotinin:为一 58氨基碱性多肽，经反复冻融后，会发生集聚，储存液应分装成小份，保存于
5、-20 度，每一小份用后应予废弃。17. PMSF：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。一旦眼睛或皮肤接触了 PMSF，应立即用大量的水冲洗。凡被 PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF 通常配成10mmol/L浓度储液（1.74 或 17.4mg/ml溶于异丙醇中）保存于-20 度。18. 显色液：联苯胺显色液（DAB）DAB 2ml10%H2O2 60lPBS(0.1mol/L PH6.4) 10ml19. 三去污裂解缓冲液0.5mol/L Tris-HCl(PH 8.0) 0.785g/100ml0.15mol/L NaCl 0.8775 g/100ml0.02%叠氮钠 0
6、.02 g/100ml0.1%SDS 0.1 g/100ml超级详细配方：SDS-PAGE、蛋白转印、Western Blot 试剂配制(*整理，2004.9.6)1.5 mol/L Tris (PH8.8)1称量 181.7g Tris 置于 1L 烧杯中。2加入约 800 ml 去离子水，充分搅拌溶解。3用浓盐酸调节 pH 值至 8.8。4定容至 1L.5高压灭菌后，室温保存。注意：应使溶液冷却至室温后再调定 pH 值，因为 Tris 溶液的 pH 值随温度的变化差异很大，温度每升高 1oC，溶液的 pH 值大约降低 0.03 个单位。（参照 kara 公司 Catalog-N1）1 mo
7、l/L Tris (PH6.8)1称量 121.1g Tris 置于 1L 烧杯中。2加入约 800 ml 去离子水，充分搅拌溶解。3按下表量加入浓盐酸调节所需的 pH 值。pH值 浓 HCl6.87.4 约 70 ml7.6 约 60 ml8.0 约 42 ml4定容至 1L.5高压灭菌后，室温保存。注意：1.溶液冷却至室温后再调定 pH 值，因为 Tris 溶液的 pH 值随温度的变化差异很大，温度每升高 1oC，溶液的 pH 值大约降低 0.03 个单位。2. 如 1 mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的 Tris。30丙稀酰胺（100ml）1称量下列试剂置于烧杯中。丙烯酰
8、胺（Acrylamide） 29 g双丙烯酰胺 (BIS) 1 g2加入约 60 ml去离子水，充分搅拌溶解。3定容至 100 ml, 用 0.45 µm滤膜滤去杂质。5于棕色瓶中 4oC保存。注意：1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。（参照 kara公司 Catalog-N1和分子克隆二版 P924）10 SDS1称量 10 g 高纯度（电泳级）的 SDS置于 100200 ml烧杯中。2加入约 70 ml去离子水，68oC 加热溶解。3滴加数滴浓盐酸调节 pH值至
9、 7.2。4定容至 100 ml，室温保存。（参照 kara公司 Catalog-N1和分子克隆二版 P924）10过硫酸铵1称量 1 g过硫酸铵。2加入约 10 ml去离子水后搅拌溶解。3储存于 4oC。注意：10过硫酸铵溶液在 4oC保存时可使用两周左右，超过期限会失去催化作用。（参照 Takara公司 Catalog-N1和分子克隆二版 P924）1SDS凝胶加样缓冲液50 mmol/L TrisCl (pH 6.8)100 mmol/L DTT2% SDS （电泳级）0.1% 溴酚蓝10% 甘油不含 DTT的 1SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，临用前必须从 1 mol/L DTT储存
10、液中现用现加于上述缓冲液中。（参照分子克隆二版 P884）本人将参照此配方，配成 5或 6，各成分浓度均扩大 5倍。另:Takara 公司 Catalog-N5上的 5SDSPAGE Loading Buffer 配方：组分浓度：250 mmol/L TrisCl (pH 6.8)10% (W/V) SDS （电泳级）0.5% (W/V) 溴酚蓝（BPB）50% (V/V) 甘油5% (W/V) -巯基乙醇（2-ME）配制量 5 ml配制方法1称量下列试剂置于 10ml 塑料离心管中。1 M TrisCl (pH 6.8) 1.25 mlSDS （电泳级） 0.5 g溴酚蓝（BPB） 25 m
11、g甘油 2.5 ml2加去离子水溶解后定容至 5 ml。3小份（500 ul/份）分装后于室温保存。4使用前将 25 ul的 2-ME加到每小份中。5加入 2-ME的 Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。1 mol/L DTT (20 ml)1称取 3.09 g DTT，加入到 50 ml塑料离心管中。2加 20 ml的 0.01 M NaOAc (pH5.2)，溶解后使用 0.22m 滤器过滤除菌。3分装后20oC 保存。（参照分子克隆二版 P884）3 M 醋酸钠（NaOAc）（100 ml）1称取 40.8 g NaOAc3H2O置于 100200ml 烧杯中，加入约
12、40ml的去离子水后搅拌溶解。2加冰醋酸调节 pH值至 5.2。3定容至 100 ml，高压灭菌后室温保存。（参照分子克隆二版 P884）0.01 M NaOAc (pH5.2)参照此配方配制。5Tris-Glycine Buffer（SDS-PAGE 电泳缓冲液）组分浓度：0.125 M Tris, 1.25 M Glycine, 0.5%(W/V) SDS1称量下列试剂置于烧杯中。Tris 15.1 gGlycine 94 g10%(W/V) SDS（电泳级） 50 ml2加入约 900 ml去离子水搅拌溶解。3定容至 1L，室温保存。（参照分子克隆二版 P884）Transfer Buf
13、fer:自配 Transfer Buffer:500ml25mM Tris base, 0.2M glycine（甘氨酸） , 20% methanol(甲醇 PH8.5)先配制 1M Tris base (MW:121.1) 100ml: 12.1g Tris base + ddH2O至 100ml,PH约 111M 12.5ml Tris base + 7.5g glycine(MW:75.05) +100ml methanol+ ddH2O 至 400ml,调好 PH值，再加 ddH2O至 500ml.先置于 4oC保存备用。（参照吴兴军给 Protoco, 据说优于分子克隆配方）丽春红
14、 S储存液（10）丽春红 S 2 g三氯乙酸 30 g磺基水杨酸 30 g加水至 100 ml。用 1份上述储存液加 9份去离子水即成丽春红 S使用液，使用后应予废弃。10X TBS (Tris-buffered saline):To prepare 1 liter of 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl; adjust pH to 7.6 with HCl (use at 1X).（参照 Cell signal Technology Protoco）Wash Buffer TBS/T:1X TBS, 0.1% Tween-20自配 Wash Buffer TBS/T:1000ml1TBS,0.1%Tween-20,100ml 10TBS+ 1ml Tween-20+ 900ml ddH2O（参照 Cell signal Technology Protoco）Blocking Buffer:1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% w/v nonfat dry milk。自配 Blocking buffer:150mlfor 150ml, add 15ml 10TBS to 135 ml water,mix.Add 7.5g nonfat milk and mix wel
