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1、1CIK 细胞对白血病微小残留病作用的研究作者：肖中平 封韬 王雪野 韩梅 肖中平【摘要 】 目的 观察 CIK 细胞对自体、异体原代白血病细胞的杀伤作用，对 G0 期 CD34+白血病细胞的细胞毒作用，及对正常骨髓造血干细胞的影响。方法 取急性白血病(AL)化疗后、慢性粒细胞白血病(CML)慢性期及正常人外周血单个核细胞加入一系列细胞因子诱导培养 CIK 细胞，流式细胞仪检测 CIK 表型，G 带法分析 CIK 细胞核型。冻存、复苏后作为靶细胞，MTT 法测定 CIK 细胞对自体、异体原代白血病细胞杀伤作用。AO 染色法测定复苏后 G0 期急性粒细胞白血病(AML) CD34+细胞比例及培养
2、后 CML CD34+细胞中G0 期细胞比例。流式细胞仪检测 CIK 细胞杀伤前后 G0 期 CD34+细胞比例变化。半固体培养法检测 CIK 细胞对正常骨髓CFUGM、BFUE 集落形成的影响。结果 CIK 细胞可从白血病患者外周血中获得，来源于正常淋巴细胞，对自体原代白血病细胞有明显杀伤作用，对 G0 期白血病细胞有明显抑制作用，对正常造血干细胞无杀伤作用。结论 CIK 细胞可作为清除残留白血病细胞的有效工具。 【关键词】 白血病；微小残留病；CIK 细胞2完全缓解的白血病患者体内，常残存耐药的、处于静止期的微小残留白血病细胞，是复发的根源。本研究从白血病患者外周血中培养出的 CIK 细胞
3、，不含有白血病干细胞，能有效杀伤 G0 期 CD34+白血病干细胞，而且这种杀伤作用具有选择性，不损伤正常造血干细胞，可以作为有效的免疫细胞来清除白血病患者体内的为微小残留病（MRD ） ，值得临床使用。1 材料和方法1.1 对象本院血液科 2005 年 1 月至 2008 年 10 月 15 例急性白血病（AL）治疗后完全缓解（CR ）患者，5 例慢性粒细胞白血病（CML）慢性期患者，5 例正常人。诊断均符合血液病诊断及疗效标准 1 。1.2 试剂和仪器白介素(IL)1 ，英国 Pepro Tech INC 公司；IL2 ，沈阳三生公司；CD3 抗体，美国 PharMingen 公司；干扰素
4、(IFN) ，英国 Pepro Tech INC 公司；CD3FITC 单抗、CD56PE 单抗、CD34APC 单抗、IgGFITC 单抗、IgGPE 单抗，美国3PharMingen 公司；EPICS XL 流式细胞仪，美国贝克曼 库尔特公司。1.3 方法1.3.1 CIK 细胞的培养与测定（1）CIK 细胞的诱导与培养：取 15 例 AL 化疗后 CR 患者、5 例 CML 患者、 5 例正常人外周血分离单个核细胞，第 1 天加入IFN 1 000 l/ml,第 2 天加入 CD3 单抗 50 ng/ml、IL2 1 000 l/ml、IL1 100 l/ml，诱导培养 CIK 细胞。
5、（2）流式细胞仪(FCM)检测 CIK 细胞表型：在培养至第 1、2、3 周时，分别取 105 CIK 细胞，标记 CD3FITC 单抗、CD56PE 单抗 20 l，对照管加入 IgGPE、IgGFITC 20 l，避光孵育 20 min，用 PBS 洗涤后，再加 1 g/L 多聚甲醛固定， 4 避光保存， 1 w 内上机检测。 （3 ）染色体 G 带法分析 CIK 细胞核型：取 4 例 CML 患者、1 例 APL 患者外周血单个核细胞培养至第 34 周 CIK 细胞 5 ml(1106/ml),加秋水仙胺至终浓度 0.03 ng/ml,置于 37、 5 CO2 孵箱中培育 3 h 后离心
6、、低渗处理、预固定、离心、固定、离心、再次固定、离心、再固定，制备中期染色体标本，Gimsa 染色后镜检及摄影。1.3.2 CIK 细胞对急、慢性白血病细胞的杀伤作用4（1）靶细胞（白血病细胞）制备：取上述患者初诊时骨髓 5 ml，肝素抗凝，以 RPMI 1640 按 21 体积混合稀释，将此稀释液缓慢加入含有 5 ml Ficoll 的离心管中，2 000 r/min 离心 20 min后吸取单个核细胞层，以 RPMI 1640 清洗 2 次后，用含 20%胎牛血清和 10%DMSO 的 1640 作为冻存保护液，程序降温至-196液氮中保存。 （2）靶细胞（白血病细胞）复苏：从液氮中取出上
7、述白血病细胞冻存管，迅速放入 37水中，摇动使其尽快融化，吸出细胞悬液，注入离心管中，加入 10 ml 培养液混匀，1 000 r/min离心 10 min，吸弃上清液，再重复用培养液洗 1 次；培养液稀释细胞至 1106/ml，接种于培养瓶中，培养 12 d，培养后台盼蓝拒染法计数活细胞95%后备用。 （3）MTT 法测定 CIK 细胞对原代急慢性白血病细胞杀伤作用：将白血病细胞浓度调至 1105/ml，效应细胞即 CIK 细胞浓度分别调至2106/ml，5105/ml，1105/ml，即效靶比分别为201、51、11。取 96 孔无菌培养板，实验组加效、靶细胞各100 l，靶细胞对照组（白
8、血病细胞）加靶细胞、培养液各 100 l，效应细胞对照组（CIK 细胞）加效应细胞、培养液各 100 l（每组设 3 个平行孔） ，置于 37、5% CO2 孵箱中培养 4 h。孵育后，各孔加入 MTT 比色液 20 l,再置于 37、5% CO2 孵箱中培养 4 h。孵育后，1 500 r/min 离心 10 min，弃上清，各孔加入 DMSO 有机溶剂 150 l，微量振荡器轻微振荡，待沉淀物充分5溶解后，在酶联免疫监测仪上检测，按以下公式计算 CIK 细胞杀伤活性：杀伤活性（% ）=1-(实验组 OD 值- 效应细胞对照孔 OD 值)/ 靶细胞对照孔 OD 值100% 。1.3.3 CI
9、K 细胞对 G0 期 CD34+急慢性白血病细胞的杀伤作用 （1）CIK 细胞对 G0 期 CD34+急性粒细胞白血病细胞 (AML)的杀伤作用检测：取上述 5 例 AML 患者复苏后白血病细胞1105/ml，按效靶比 101 加入自体 CIK 细胞，在 37、饱和湿度条件下作用 4 h，同时设置阴性对照组。将上述 2 组细胞标记CD34APC 单抗后，甲醛固定 2 h 后，加入 AO 染色液 2 ml 在冰浴条件下染色 10 min 后上机分析。 （2）CIK 细胞对 G0 期 CD34+慢性白血病细胞的细胞毒作用 直接免疫磁珠法富集 CML 患者的CD34+细胞 取上述 5 例 CML 患
10、者肝素抗凝骨髓 5 ml，经淋巴细胞分层密度梯度离心分离，将 BMMNC 悬浮于含 5 mmol/L 的EDTA 500 l PBS 中，先加入非特异性结合阻断剂 100 l,6孵育20 min，缓冲液洗涤后悬浮于 500 ml PBS 中备用。将 MiniMACS分离柱置于永久磁场的分离器上，以 500 l 缓冲液洗柱后，将细胞悬液加于柱顶，然后以 500 l 缓冲液洗柱 4 次；将分离柱移出磁场，加 1 ml 缓冲液于柱顶，加压使 CD34+细胞洗脱下来，离心，重悬6于 100 l。取样计数细胞，取富集后 CD34+细胞 1105/ml，加入 10 l CD34单抗，避光孵育 20 min
11、，洗涤后通过 FCM 检测。体外培养法选择 CML 白血病细胞：将富集的 CD34+细胞以H5100 调至 1106/ml,在 37、保和湿度、 CO2 条件下培养 3 d。CIK 细胞对 CML CD34+干细胞中 G0 期细胞杀伤作用的测定 取培养后的 CML CD34+细胞 1105/ml,按效靶比 101 加入 CIK细胞，在 37、饱和湿度、5%CO2 条件下作用下 4 h，同时设置阴性对照组。将上述 2 组细胞标记 CD34APC 单抗后，甲醛固定2 h 后，加入 AO 染色液 2 ml，在冰浴条件下染色 10 min 后上机分析。1.3.4 正常骨髓 CFUGM、BFUE 集落培
12、养一组取本院骨髓无转移的实体瘤患者（3 例）BMMNC 5104/ml 种入含有 GMCSF、GCSF 、SCF、EPO 因子甲基纤维素半固体培养基，放置于 37、5%CO2 孵箱中培养，第 14 天计数 CFUGM、BFUE 集落数量。另一组按效靶比 201 加入培养的自体 CIK 细胞，第 14 天计数 CFUGM、BFUE 集落数量。1.4 统计学处理采用样本均数的 t 检验、方差分析。72 结 果2.1 CIK 细胞的增殖2.1.1 CIK 细胞的增殖随着培养时间增加，CIK 细胞数量明显增多，见图 1。2.1.2 CIK 细胞表型分析来源于 AL 缓解患者、CML 患者的 CIK 细
13、胞，随着培养时间延长，CD3+细胞数量明显增加，第 3 周分别达到(98.094.12)%、(97.293.55)%，CD3+CD56+细胞数量分别达到 (30.2811.74)%、(31.648.52)%，与来源于正常人 CIK 细胞(355)%无明显差异（P 0.05） ，图 2。2.1.3 染色体分析G 带法检测来源于有染色体异常患者（5 例）的 CIK 细胞均为正常核型（图 3） ，表明 CIK 细胞为非白血病源性。2.2 CIK 细胞对原代急慢性白血病细胞的杀伤作用 见图 4。82.3 CIK 细胞对 G0 期 CD34+原始白血病细胞的细胞毒作用CIK 细胞对 G0 期 CD34+
14、急性白血病细胞有明显细胞毒作用，平均杀伤率 47%。CIK 细胞对 CD34+慢性白血病细胞有杀伤作用（图 5、图 6） ，平均杀伤率 66.73%。2.4 CIK 细胞对正常骨髓 BFUE、CFUE 集落形成影响对照组与加入 CIK 细胞组的 CFUGM 集落数分别为15016、14520(P 0.05) ，BFUE 集落数分别为685、688(P0.05) ，表明 CIK 细胞对正常骨髓干细胞生长无明显抑制作用。3 讨 论近 20 年来，由于化疗、造血干细胞移植及靶向治疗的发展，急、慢性白血病的治疗取得巨大进展，白血病的 CR 率已有明显提高，急性白血病 CR 率可达 60%80%，大部分
15、慢性期 CML 患者可获得细胞遗传学及分子生物学缓解，生存时间也明显延长，但白血病 5 年长期生存率仍只有 20%30%，大部分患者因复发而死亡。目前许多研究者认为 CR 期间体内 MRD 是复发的主要根源。MRD9是指临床上达到 CR，但体内仍有微量的、凭形态学方法无法检测到的白血病细胞残留。利用现代检测技术 RTPCR、FISH、FCM 证实了在完全缓解的急、慢性白血病患者体内存在 MRD。如何去除MDR，提高白血病患者长期生存率成为人们研究的热点。化疗无法清除 MRD，一方面由于残留的白血病细胞高表达 gp170 蛋白，多为多药耐药，对化疗药物不敏感2 ；另一方面有研究者通过分析增殖相关
16、标记物 Ki67 及 P120，发现只有 16%的残留肿瘤细胞处于细胞周期中，大部分细胞静止于 G0 期，抵制化疗药物的杀伤，这些细胞一旦能够从 G0 期进入细胞周期，则持续增殖，导致白血病复发。目前治疗 MRD 尚无理想方法。近年来人们逐渐认识到 MRD 的根除在很大程度上依赖免疫系统。异基因造血干细胞移植后移植物抗白血病（GVL）作用以及异基因造血干细胞移植后复发的患者，给予供者淋巴细胞输注（DLI）能达到再次缓解也证实免疫细胞对杀灭白血病细胞起着很重要的作用3 。本实验探讨应用过继细胞免疫疗法杀灭残留白血病细胞的可行性。结果表明：CIK 细胞可从白血病患者外周血中获得，来源于正常淋巴细胞，能够在体外大量扩增，与来源于正常人的 CIK 细胞表型无明显区别。CIK 细胞对
