《CFSE检测马传染性贫血病毒疫苗免疫马T细胞增殖方法的建立》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CFSE检测马传染性贫血病毒疫苗免疫马T细胞增殖方法的建立（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1CFSE 检测马传染性贫血病毒疫苗免疫马 T 细胞增殖方法的建立作者：林跃智, 邓喜林, 沈楠, 吕晓玲, 赵立平 孔宪刚, 邵一鸣, 周建华【摘要 】 目的: 以流式细胞术(FCM)检测马传染性贫血病毒（EIAV）抗原特异性的 T 淋巴细胞增殖。方法: 将新鲜分离的马外周血单个核细胞（PBMC）进行 CFSE 染色, 经纯化病毒体外刺激并培养 5 d 后, 进行 T 淋巴细胞亚型标记, 检测特异性增殖的 CD4+和 CD8+细胞比例。结果: 对马 PBMC 的染色浓度、 特异性刺激物的种类及反应时间等条件进行了优化。可对马外周血抗原特异性 T淋巴细胞不同亚型的增殖水平进行定量评价 。结论:
2、 FCM 检测方法为研究马传染性贫血病毒疫苗免疫保护机制提供了一个有效的手段; 该法也可以为其他病毒的免疫学研究提供借鉴。 【关键词】 T 细胞增殖; CFSE; 马传染性贫血病毒T 淋巴细胞对抗原、 有丝分裂原(mitogen)和 T 淋巴细胞抗受体（antirecepter ）抗体的反应能力是衡量机体免疫状况和淋巴细胞功能状态的重要指标。体外检测细胞分裂最常用的方法是 MTT 比色法和 3HDNA 掺入法, 这两种方法虽然能够提示细胞群体的分裂水2平, 却不能反映单个细胞的分裂状况, 还存在放射性危害等局限性1, 2 。随着流式细胞术（ FCM）的发展, 多种荧光染料应用于细胞增殖的检测中
3、, 其中以 CFSE 的应用最为广泛。CFSE 为一种活体染料（羧甲基荧光素乙酰乙酸）, 可自发地与细胞表面或细胞内蛋白成分中的赖氨酸侧链以及其他氨基酸的侧链氨基形成稳定不可逆结合。当细胞分裂时, 其标记物可平均分配到两个子代细胞中, 具有荧光系列减半的特征, 可以从单细胞水平上检测淋巴细胞的增殖能力。CFSE 可以较稳定的存在于细胞内长达数月之久, 并且不会改变细胞表面抗原, 影响细胞功能, 已经广泛应用于体内和体外细胞的示踪试验, 并取得了较好效果3 。另外, CFSE 可以联合其他荧光染料对 T 淋巴细胞不同亚型进行评价, 为机体免疫状态提供更全面的信息。我国自主研制的马传贫弱毒疫苗是惟
4、一大规模应用的慢病毒疫苗, 对其免疫保护机制的探讨将对研究慢病毒免疫提供重要的参考。抗原诱导 T 淋巴细胞的克隆扩增水平是反映机体免疫状态的重要指标之一4, 5 。因此, 建立一种有效的, 稳定的检测细胞增殖的方法对机体免疫状态的衡量及疫苗的免疫评价尤为重要。本研究中, 我们建立了 CFSE 检测马不同 T 淋巴细胞亚型增殖的方法。并对强毒感染马和疫苗株免疫马 CD4 和 CD8 T 淋巴细胞的增殖情况进行了3初步检测, 验证了该方法的实用性和稳定性, 所建立的方法也将进一步应用于马传贫弱毒疫苗免疫机制的研究中。1 材料和方法1.1 材料 EIAV 疫苗株 FDDV, EIAV 强毒株 LV
5、均由本试验室保存。FDDV 经密度梯度离心纯化, EIAV p26 和 p15 蛋白由本实验室用原核系统表达并纯化。含有 EIAV 核心蛋白（ gag）的重组痘苗病毒由中国疾病预防与控制中心性病艾滋病中心提供。直接加入的gag 保守区短肽序列分别为 KTWWAIAAVKMGLQINTVNGAK; STFSILKAKFERKTANTTKKQS; MGLQINTVNGAKSTFSILKAKFER和 GPKEPYPEFVDRLLSQIKSEGHPADITKFLTD, 由西安美联公司合成。马匹购自通辽, 雄性, 23 岁, 试验前经 2 次免疫琼扩检测均为EIAV 阴性。马匹随机分为 EIAV 强毒株
6、（LV） 、 疫苗株（DLV ）和健康对照 3 个组。强毒株和疫苗（ CFSE）日本三联室保存 , kit 购自Molecular Probe 公司; 人重组 IL2 购自 Roche 公司; 马血清和细胞培养制剂 RPMI1640 购自北京原平浩生物技术公司; 马 CD4和 CD8 抗体购自 VMRD 公司; PHA 购自 Sigma 公司; 其余试剂均为国产分析纯。1.2 方法41.2.1 马外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMC）的制备 采集肝素抗凝马全血 20 mL, 3 500 r/min 离心 15 min。吸取白细胞富集
7、层与 2 倍体积的 PBS（pH7.1）混匀后, 将 PBS细胞混合液缓慢加入等量的淋巴细胞分离液中, 2 000 r/min 离心 10 min。吸取中间的白细胞富集层 , 加入等体积的 PBS, 1 500 r/min 离心 10 min。重悬细胞沉淀, PBS 洗 3 次。用含有 20万 U/L IL2 的 RPMI1640 完全培养液（100 mL/L 马血清, 100万 U/L 青霉素, 100 mg/L 链霉素, 10 g/L 谷胺酰氨, 10 g/L HEPES）重悬细胞, 计数备用。1.2.2 CFSE 标记马外周血单个核细胞 新鲜分离的马外周血单个核细胞细胞数调至 11010
8、/L, CFSE（贮存浓度 10 mmol/L）用DMSO 稀释至 510-6 mol/L, 逐滴的加入到细胞中, 混匀, 置37孵育 10 min 后加入等量灭活胎牛血清, 冰浴 5 min, 1 000 r/ min 离心 10 min。用 RPMI1640(100 mL/L FBS)培养液清洗细胞3 次。RPMI1640 完全培养液悬浮细胞 , 调整细胞数为 2106/L。接种 96 孔板, 每孔 200 L。每个样品各设 3 个病毒刺激孔（5107 pfu EIAV） , 3 个阴性对照孔（5 L/孔马血清）和 3 个PHA 刺激孔（25 mg/L）, 37、 60 mL/L CO2
9、继续培养 5 d。1.2.3 细胞亚型的标记 将收获的细胞用 PBS (含 10 mL/L FBS)洗涤 2 次, 分别加入鼠抗马 CD4 和 CD8 mAb（1 L/孔） 。混匀后5室温孵育 30 min, PBS (含 10 mL/L FBS)清洗 2 次后加入 APC 标记抗鼠 IgG 的荧光二抗, 室温孵育 30 min, PBS (含 10 mL/L FBS)清洗 2 次后重悬。最后在每孔加入 100 L 多聚甲醛（20 g/L）, 室温固定 10 min 后重悬细胞, 经 FCM 检测。1.2.4 FCM 检测及分析 应用流式细胞仪（ Beckman FC500） 将每个样品分析
10、10 000 个细胞。获取的数据经 Cell Quest 软件分析。首先通过前散射（FS）和侧散射（SS ）二维散点图 , 划出淋巴细胞区。其他的多荧光标记和测定按常规进行。通过 Fliter 1（494 nm）和 Fliter 4（650 nm）进行光波收集。2 结果2.1 CFSE 标记浓度对增殖检测的影响 CFSE 标记效率对不同类型细胞存在差异。采用不同浓度的 CFSE（ 5.0 mol/L、 2.5 mol/L 和 1.0 mol/L）标记马的 PBMC, 测定了不同时间点的马PBMC 增殖水平。1 d 内 CFSE 在细胞内有一个平衡期, 2 d 后细胞出现不同程度的增殖。随着刺激
11、时间的延长, 增殖水平也逐渐增强, 并出现多个分裂周期。在相同刺激条件下, 5.0 mol/L 和 2.5 mol/L 的染色浓度增殖水平要高于 1.0 mol/L, 而 2.5 mol/L 也略高于 5.0 mol/L(图 1)。因此, 马 PBMC 增殖测定 CFSE 最佳使用浓度被确定为 2.5 mol/L。62.2 有效刺激原的选择 有效的刺激原在体外能够被致敏的 T 细胞捕获、 加工和提呈, 刺激效应细胞产生免疫应答。本试验中, 分别选取了 gag 基因原核表达产物 p15 (20 mg/L)和 p26 (20 mg/L)、表达 gag 基因的重组痘苗病毒 (RVV)和 4 种位于
12、gag 基因保守区的短肽 (20 mg/L)以及纯化的 FDDV 病毒 (5107 pfu)作为体外刺激物。结果表明, 只有纯化的全病毒在体外能够有效的诱导 T 淋巴细胞增殖（图 2） 。2.3 不同 T 细胞亚型增殖水平 采用双染法对不同 T 细胞亚型进行增殖检测。首先通过前散射（FS）和侧散射(SS)二维散点图圈定PBMC 中的目的细胞, 再分别由马 CD4+和 CD8+T 细胞标记抗体（APC）和 CFSE 进行亚型划分。设定 FL1 荧光通道检测 CFSE 的荧光强度, FL4 荧光通道检测 APC 的荧光强度。(G+H) 区为整体CD4+或 CD8+T 在 PBMC 中的比例, H
13、区则为发生增殖的 CD4+或 CD8+T 细胞, 因此, 我们用 H/G+H 来表示 CD4+或 CD8+ T 细胞的增殖指数（cell division index）CDI。疫苗免疫马诱导产生CD4+和 CD8+ T 细胞增殖比例均高于强毒感染马和健康马(图 3)。2.4 不同病毒接种马的 T 细胞亚型增殖比例 在建立了双染色流式分析术检测不同 T 细胞亚型增殖的方法之后, 我们采用该方法对同期疫苗免疫马, 强毒感染马（出现发热、 血小板减少等临床症状7一次）和健康马进行了定点检测（2.5 个月） , 以测试该方法在研究慢病毒感染免疫上的实用性。经体外病毒诱导的不同试验组马匹的CD4+及 C
14、D8+T 淋巴细胞增殖情况（图 4、 5） 。各组实验马增殖细胞均以 CD4+ 细胞为主。并随着免疫时间的延长呈现波动上升的趋势。免疫 3 个月时, 疫苗免疫马 CD4+T 细胞增殖比例为 15.5%, 明显高于强毒感染马（6.7%）和健康马（3.9%） 。不同试验组马匹病毒诱导的 CD8+T 淋巴细胞增殖情况 , 也具有相同的趋势和特点（免疫马 vs 强毒马: 7.8 % vs 4.3%） 。3 讨论在体外, 静止期 T 淋巴细胞可在多种因素诱导下活化分裂。这些因素包括 TCRmAb、 抗 CD3mAb、 超抗原及植物血凝素等。在同一刺激条件下, 功能越成熟的细胞分裂能力越强。然而, 细胞克
15、隆扩增后简单的评价 T 细胞数量并不能够有效地反映细胞的分裂能力, 也无法区分这种扩增是由于分裂周期的增加, 还是存活率的增加6, 7 。传统评价细胞增殖能力的 MTT 比色法、 3HTdR 掺入法和 BrdU 标记法都无法实现对细胞分裂周期的定量检测。CFSE 是一种非极性分子, 可自由穿透细胞膜 , 进入细胞内被酯酶转化成带负电荷的 CFSE 并释放荧光。一旦进入细胞后的 CFSE 不能从细胞中释放或被代谢降解, 因而随细胞的增殖分裂进入子代细胞, 使荧光强度呈对半递减。因此, 该种方法不但可以检测细胞的增殖8水平, 还可以评价细胞的分裂周期8 。此外, 传统的细胞增殖测定法只能对活细胞进
16、行检测, 而无法与某些已经分裂又发生死亡的细胞区别。而使用 CFSE 标记, 死亡的细胞在几天内可保持荧光强度基本不变, 并可使用其他染料将其与活细胞区分开来, 为增殖分析提供了更加全面的资料3, 9 。在获得性免疫应答中, 抗原特异性淋巴细胞的克隆扩增对于抵御病原体是非常必要的。克隆扩增的发生在初始免疫过程中可以产生大量效应细胞, 也可以提高抗原特异性记忆性细胞的数量10 。初始致敏的 T 细胞克隆扩增的程度与长期免疫应答具有相关性3, 11-13 。因此 , 在疫苗的研究中 , 就有应用提高抗原特异性淋巴细胞的增殖能力来提高机体免疫应答水平的方法。例如, 免疫佐剂的使用（通过诱导 APC 细胞分泌多种细胞因子来诱导淋巴细胞增殖） 。研究发现, HIV 的感染使得 CD4+T 淋巴细胞增殖能力的降低4, 14 。尽管还没有明确的证据表明 HIV 感染者中 CD
