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1、1CFSE 标记抗原特异性 CD4+CD25+T 细胞在胰岛移植体内归巢的研究作者：张梅,徐书杭, 徐瑜,刘翠萍, 茅晓东,徐宽枫,刘超【摘要 】 目的 : 观察抗原特异性 CD4+CD25+Treg 细胞在小鼠同种异体胰岛移植后体内的分布特点, 探讨抗原特异性CD4+CD25+Treg 细胞免疫调节可能机制。方法:构建小鼠同种异体胰岛移植模型。CFSE 对抗原特异性 CD4+CD25+Treg 细胞标记, 经尾静脉输注。用组织冰冻切片和流式细胞术动态了解 CFSE 标记的抗原特异性 CD4+CD25+Treg 细胞在受体内的分布和增殖变化。结果: 抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细
2、胞联合胰岛移植组胰岛移植物平均生存期为(34.5717.15) d, 较胰岛移植组生存时间(10.61.82) d, 差异有统计学意义(P0.01)。抗原特异性CD4+CD25+ Treg 细胞在各级淋巴结均有能定居, 但是胰腺淋巴结定居的细胞数量明显多于其他淋巴结。结论:抗原特异性 Treg细胞抑制 STZ 诱导的糖尿病小鼠的急性移植排斥反应, 细胞抑制功能与细胞在体内淋巴结的归巢有关。AIM: To observe the distribution and proliferation of the antigenspecific CD4+CD25+ regulatory T (Treg )
3、 cells and investigate the potential mechanism of antigenspecific CD4+CD25+ regulatory T cells on the suppression of 2rejection for allogenetic islet transplantation in vivo. METHODS: Antigenspecific CD4+CD25+ Treg cells were generated by the addition of multiple intravenous injections of ICR mice s
4、plenocytes in vivo. After labeled by CFSE, 8105 antigenspecific Treg cells were injected via tail vein with islets transplantation. Homing and distribution of antigenspecific CD4+CD25+ Treg cells were investigated by flow cytometric analysis and immunofluorescence. RESULTS: In vivo, the mean surviva
5、l time of recipients with islets and antigenspecific CD4+CD25+ Treg cells were (34.5717.15) days, whereas transplanted islets without Treg treatment survived (10.61.82) days in control mice. The transferred antigenspecific CD4+CD25+ Treg cells were mainly resident in pancreatic node and mesenteric n
6、ode. CONCLUSION: Allogeneic antigenspecific CD4+CD25+ Treg cells prolong islet graft survival, and draining lymphoid tissue play a key role in the immune response. 【关键词】 CD4+CD25+调节性 T 细胞; 胰岛/ 移植; CFSE胰岛移植是治疗 1 型糖尿病理想的方法。近年来, 较多研究发现 CD4+CD25+调节性 T 细胞(regulatory T cell, Treg)在调节移3植免疫中起重要作用1 。Treg 细胞主
7、动免疫调节作用为移植排斥反应的治疗开辟了一条新途径。选择合适的细胞标记物跟踪观察, 对于研究移植后的细胞在体内作用机制具有重要作用。在构建小鼠胰岛移植模型的基础上, 我们将标记荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5, 6carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE) 抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞回输至体内, 以观察细胞在体内的生物学特性, 从而对抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞在同种异体胰岛移植排斥反应的调控机制进行初步研究。1 材料和方法1.1 材料 清洁级 ICR 小鼠(雌雄不拘, 体质量 2
8、535 g) 购自江苏省实验动物中心; 清洁级 BALB/c ByJ 小鼠(雄性, 体质量2528 g) 购自南京大学模式动物中心(ICR 和 BALB/cByJ 小鼠分别作为移植的供体和受体。无特殊病原菌饲养级饲养)。链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)和型胶原酶购自 Sigma 公司; 小牛血清购自 Hyclone 公司; RPMI1640 培养液购自 Gibco 公司; Histopaque分离液购自 Pharmacia 公司; 胰岛素 ELISA 试剂盒购自 Linco 公司; PECy5antiCD3、 PEantiCD4 和 FITCantiCD25 抗体均购自 C
9、altag 公司; 小鼠 CD4+CD25+T 细胞磁珠分离试剂盒购自Miltenyi Biotec 公司; CFSE 购自 Fluka 公司 ; XYH2A 体视显微镜购自上海光学仪器公司; 优越型血糖仪购自 Roche 公司; 4BIORAD2100 型激光共聚焦显微镜购自 BioRad 公司; FACSCalibur 流式细胞仪购自 Becton Dickinson 公司。1.2 方法1.2.1 实验设计 STZ 诱导糖尿病 BALB/cByJ 小鼠为受体; ICR 小鼠为供体; 实验分为 3 组: A 组: 糖尿病 BALB/cByJ 小鼠对照组(n=5); B 组: 糖尿病 BALB
10、/cByJ 小鼠胰岛移植组(n=5); C 组: 糖尿病 BALB/cByJ 小鼠胰岛移植联合抗原特异性 CD4+CD25+ T 细胞组(n=7)。在胰岛移植前经尾静脉回输 8105 个抗原特异性CD4+CD25+ T 细胞。正常对照组(n=5) 。1.2.2 抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞制备 取制备好的ICR 小鼠单个核细胞悬液, 加入 MMC(25 mg/L)37孵育 30 min, PBS 洗涤 2 次, 1 200 r/min, 离心 5 min, 重悬于 PBS 液, 调整细胞密度 21010/L, 分别免疫 BALB/cByJ 小鼠 0.5 mL/次, 尾静脉注射
11、, 每周 1 次, 连续 3 周。于第 3 次免疫后第 5 天, 分别取出被免疫的 BALB/cByJ 小鼠的脾脏制备淋巴细胞悬液。MACS 法分离CD4+CD25+ Treg 细胞2 。1.2.3 小鼠胰岛分离 ICR 小鼠, 非禁食 , 10 g/L 戊巴比妥麻醉后手术区消毒, 腹部 V 字型切口, 结扎近十二指肠端胆总管, 靠肝5门近端逆行插入 26G 静脉注射针。破心放血处死动物。将冷胶原酶溶液从插管处灌注 4 mL, 迅速完整的摘取胰腺放入含 1 mL 冷胶原酶试管中, 于 37水浴静止消化 1215 min, 在涡流震荡器上震荡10 s, 呈细沙状 , 然后放置冰上 , 立即加入含
12、 100 mL/L 小牛血清的4 Hank 液, 终止消化。 30 目不锈钢细胞筛过滤, 去除淋巴结等组织。1 000 r/min, 离心 2 min, 弃上清, Hank 液洗涤 2 遍。1.2.4 糖尿病小鼠模型的制备 BALB/c 小鼠, 禁食 12 h, 用柠檬酸 柠檬酸钠溶液(pH4.5) 溶解 STZ。按 200 mg/kg 体质量单剂量腹腔注射, 4872 h 后尾静脉采血, 全血血糖16.7mmol/L, 且出现明显清瘦、 多食、 多饮、 多尿, 且维持 1 周以上者确定为糖尿病模型建立。1.2.5 同种异体胰岛移植 10 g/L 戊巴比妥腹腔麻醉, 暴露左肾, 从肾下极沿包膜
13、下间隙游离至上极, 注射分离的新鲜胰岛（500 600 个）, 缝合。糖尿病对照组肾包膜下注射 30 L 生理盐水。移植后第 1 周每日测量血糖 , 自第 2 周起每周测量 2 次血糖。以非禁食血糖11.1 mmol/L 判定为移植物存活, 移植有效。连续 2 次血糖11.1 mmol/L 为移植物排斥, 以出现第 1 次升高的时间为排斥时间。1.2.6 CFSE 标记抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞并回输 6用 PBS 液调整抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞悬液的密度为1109/L。加入等体积的 CFSE 工作液。充分混匀, 37孵育 10 min。PBS 洗涤细
14、胞 2 次, 1 500 r/min, 离心 5 min, 弃上清。重新悬浮细胞于 PBS 液, 并调整细胞密度为 1109/L 。将 CFSE 标记的抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞, 经尾静脉注射到受体体内。1.2.7 抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞示踪检测 分别于细胞输注后不同时间点处死取小鼠, 将每组小鼠(n=2)以颈椎脱臼法处死并放血。取小鼠淋巴结、 脾脏, 切除小部分留作组织学检查荧光标记细胞分布, 其余留作流式细胞术 (FCM)检查。所有动物不计入生存期观察。1.2.8 抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞体内增殖的检测 制备淋巴细胞悬液,
15、 将分离的受体淋巴细胞重新悬浮于 200 L 的PBS 液。加 2.5 L PEantiCD25 抗体, 4, 避光孵育 30 min。PBS 洗 2 次, 1 200 r/min, 离心 5 min。0.5 mL PBS 重悬细胞。流式细胞仪检测。以未进行 CFSE 标记的细胞为阴性对照 , 以CFSE 标记的回输前细胞为阳性对照。1.2.9 抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞体内分布的组织学检测 将获取肠系膜、 腹股沟和胰腺的淋巴结迅速放置于 OCT 包埋剂中, 行冰冻切片术, 切片 5 m 厚。在共聚焦显微镜下观察。同7时取正常小鼠淋巴结组织做阴性对照。1.2.10 统计学分
16、析 实验数据以 xs 表示。使用 SPSS10.0软件分析, 2 组间比较采用 t 检验, 存活率用 KaplanMeier 分析。P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 抗原特异性 CD4+CD25+Treg 细胞延长胰岛移植物存活时间 抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞明显延长胰岛移植物存活时间。7 只接受 8105 个抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞联合胰岛移植的糖尿病小鼠全部在 24 h 内恢复正常的血糖(10 mmo1/L), 实现了胰岛素的不依赖性。抗原特异性 CD4+CD25+ Treg 细胞联合胰岛移植组胰岛移植物平均生存期为(34.5717.15) d, 较胰岛移植组生存时间(10.61.82) d, P0.01 为差异有统计学意义。2.2 抗原特异性 CD4+CD25
