《CD59特异位点的短肽封条对HeLa细胞凋亡作用的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CD59特异位点的短肽封条对HeLa细胞凋亡作用的研究（14页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1CD59 特异位点的短肽封条对 HeLa 细胞凋亡作用的研究作者：李丽, 池沛冬, 孟锐, 杨滨燕, 吴长有【关键词】 BrdU 增殖 流式细胞仪 细胞活化Abstract AIM: To investigate the correlation of BrdU incorporation with the activation and cytokine expression of T cells. METHODS: PBMCs from healthy persons were isolated and stimulated by PMA plus Ionomycin at differen
2、t periods of time, BrdU was then added to the cells one hour before the end of culture. The cells were harvested and stained with antiBrdU, anticell surface and intracellular antibodies. Then the cells were washed and analyzed by flow cytometer. RESULTS: The peak of BrdU incorporation was observed i
3、n T cells after they were stimulated for 48 hours in vitro, but no further increase of the peak of BrdU incorporation was found after incubated for a longer period of time. The comparison made between BrdU incorporation and cell activation indicated CD69 expression reached the peak after stimulated
4、for 8 hours whereas CD25 was at the peak after stimulated 2for 24 hours. Furthermore, no correlation between BrdU incorporation and cytokine production was observed. High frequency of IFN producing cells was detected after stimulated for 8 hours but no obvious increase was observed for a longer peri
5、od of time. When PBMC were stimulated with OKT3 plus antiCD28, the percentage of BrdU+ T cells was higher than that stimulated by PMA plus Ionomycin. Similarly, the percentage of BrdU+CD8+ T cells was higher than that of BrdU+CD4+ T cells. CONCLUSION: The percentage of BrdU+ cells can be detected by
6、 flow cytometer to evaluate the proliferation of T cells. Only a few T cells proliferate after polyclonal stimulation and BrdU incorporation is dependent on stuimulants and time of stimulation. Therefore, BrdU incorporation is not correlated with activation markers and cytokine production.KeywordsBr
7、dU; proliferation; flow cytometer; cell activation通常, 人们都是通过 3H脱氧胸腺嘧啶苷掺入法或 MTT 比色法来检测 T 细胞增殖, 这些方法测定步骤较多 , 或敏感性相对较低, 且不能从单个细胞水平评价细胞增殖, 具有一定限制性。与这些方3法不同, 脱氧胸腺嘧啶苷的类似物5 溴脱氧尿苷(Bromodeoxyuridine, BrdU)可在细胞合成 DNA 时替代胸腺嘧啶, 通过固定和破膜, 加入荧光标记的抗 BrdU 抗体, 利用流式细胞术检测 BrdU 掺入率, 从而反映细胞增殖水平1。因此, BrdU 掺入法在检测细胞增殖时, 同时还
8、可以检测表面和胞内分子的表达, 从而实现了在单个细胞水平分析细胞增殖。本研究我们系统地比较了不同刺激条件下 T 细胞的增殖及其与细胞活化分子和细胞因子表达的关系, 为基础和临床研究提供科学依据。1 材料和方法1.1 材料 APC 标记的抗 CD4 抗体(APCCD4) 、 APCCD8、 PECD3、 APCIFN、 APCIL2 以及相匹配的对照抗体, 鼠抗人 CD28 单克隆抗体（mAb） 、 鼠抗人 CD3 mAb（antiCD3）均购自 BD/Pharmingen 公司(Becton Dickinson/PharMingen USA); PMA、 Ionomycin、 Brefeldi
9、nA（BFA）及 PI 均为 Sigma 公司产品, FITC BrdU Flow Kit 试剂盒为 BD 公司产品。RPMI1640 培养基干粉购自 Gibco 公司。流式细胞仪（FACS Calibur）购于美国 BD 公司。1.2 方法41.2.1 人外周血单个核细胞（PBMC）的分离 抽取健康人静脉血, 肝素抗凝。Hanks 液等体积稀释, 用 Ficoll 进行密度梯度离心（800 g, 22, 20 min）, 获取外周血单个核细胞, 充分洗涤后, 用 RPMI1640 培养液调整 PBMC 密度为 1109/L。1.2.2 淋巴细胞体外刺激培养及 BrdU 掺入 将 PBMC 1
10、109 细胞/L 培养于 48 孔培养板中, 1 mL/孔, 加入 antiCD28 (OKT3)（0.2 mg/L） +antiCD28（1 mg/L）或 PMA（20 g/L）+Ionomycin（1 mg/L） 。培养板置于 50 mL/L CO2、 37培养箱培养, 分别刺激 8、 24、 48 和 72 h, 培养结束前 6 h 分别加入10 mg/L Brefeldin A（BFA）, 并于培养结束前 1 h 加入 10 mL/L BrdU（终浓度为 10 mol/L）, 继续孵育至培养结束 , 收集细胞。1.2.3 细胞染色 收集细胞后, 首先用染色缓冲液（ Staining b
11、uffer）洗涤细胞 2 次, 100 L 染色缓冲液重悬细胞, 之后加入表面染色抗体, 置 4避光染色 25 min, 染色缓冲液洗涤 1 次, 吸弃上清, 100 L 固定/通透缓冲液（Cytofix/cytoperm）重悬细胞, 室温避光反应 20 min, 通透/洗涤液洗涤细胞 1 次。加入 100 L 加强通透液（Cytoperm plus） 4 避光反应 10 min, 通透/洗涤液洗涤细胞 1 次, 之后再加入 100 L 固定/通透缓冲液重悬细胞, 室温再次固定细胞 5 min, 通透/洗涤液洗涤细胞 1 次。每管加入 100 L稀释后的 DNase, 置 37培养箱孵育 1
12、h, 通透/ 洗涤液洗涤细胞 15次。加入 50 L 通透/洗涤液稀释后的 BrdUFITC 抗体以及胞内抗细胞因子抗体, 室温避光反应 20 min, 通透/ 洗涤液再次洗涤细胞 1次。200 L 染色缓冲液重悬细胞,流式细胞术（BD Calibur, USA）进行检测, 并用 Flow Jo 软件分析检测结果。1.2.4 PI 染色 收集细胞后, PBS 洗涤细胞 2 次, 细胞表面分子按常规染色方法进行, 之后 200 L PBS 重悬细胞, 加入 10 L PI, 混匀, 反应 1020 min 上机进行检测。2 结果2.1 刺激时间与 BrdU 掺入之间的关系 为了确定 BrdU 开
13、始掺入的时间, 我们利用 PMA+Ionomycin 刺激 PBMC 8、 24、 48 和 72 h 后, 检测不同时间点 CD3+T 细胞 BrdU 的掺入率。结果表明(图 1), 与未刺激组相比 , 刺激细胞 8 h 时, 未见明显 BrdU+T细胞(2%), 当刺激细胞 48 h 时, BrdU+T 细胞的百分率（9.21%）明显增加, 且与 72 h 掺入率(10.60%) 相比, 没有明显变化。图 1 PMA+Ionomycin 刺激时间与 BrdU 掺入之间的关系（略）6Fig 1 Correlation of PMA+Ionomycin stimulation and BrdU
14、 incoporation2.2 BrdU+T 细胞掺入与活化分子表达的关系 由上述不同时间点 BrdU 掺入率的结果可以看出, 在 PMA+Ionomycin 刺激的条件下, 48 h 后细胞才有明显增殖。为了确定细胞的活化与增殖之间的关系, 我们检测了以上不同时间点活化分子 CD69 和 CD25 的表达。由图 2 可以看出, 未刺激的 T 细胞基本无 CD69 的表达, 但刺激 8 h 后 CD69 已有明显表达, 且 72 h 内的表达维持在稳定水平。与 CD69 的变化趋势有所不同, CD25 的表达发生在 CD69 之后, 细胞刺激后 24 h CD25 的表达明显增加, 48 h
15、 达到峰值, 之后有下降的趋势。而 BrdU 的掺入在刺激 48 h 时才有明显的增加, 然后稳定在一定的水平。因此, 细胞活化发生在细胞增殖之前, 二者并不同步。图 2 BrdU 掺入与活化分子表达的关系（略）Fig 2 Correlation between BrdU incoporation and expression of activation markers2.3 PMA+Ionomycin 刺激不同时间后 BrdU 掺入与细胞因子 IFN 和 IL2 表达的关系 由上述结果可以看出, 细胞增殖与活7化的发生并不一致, 那么细胞增殖与细胞因子的表达是否也存在相似的关系, 因此, 我
16、们又检测了不同时间点 BrdU 掺入与 IFN 表达的关系。由图 3 可以看出 , PMA+Ionomycin 刺激细胞后 8 h, 即有大量 IFN 表达, 在之后的各时间点之间 IFN 的表达并无明显改变。相反, 在刺激细胞 8 h 与 24 h 时无明显 BrdU 掺入, 在 48 h和 72 h 时可见有 BrdU 掺入, 此外, 可见 IFN 单阳性、 IFN和 BrdU 双阳性和 BrdU 单阳性细胞, 表明细胞增殖与细胞因子表达并不一致。为了进一步明确是否 BrdU 掺入与其他细胞因子之间也存在着类似的关系, 我们又检测了 72 h 时 BrdU 掺入与 IL2 分泌的关系。所获结果与 BrdU 掺入和 IFN 的关系相类似。图 3 PMA+Ionomycin 刺激不同时间后 BrdU 掺入与细胞因子 IFN 和 IL2 表达的关系（略）F
