《CD25分子胞外段基因免疫应答中B淋巴细胞的变化及意义》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CD25分子胞外段基因免疫应答中B淋巴细胞的变化及意义（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1CD25 分子胞外段基因免疫应答中 B 淋巴细胞的变化及意义作者：徐林，张凤，周涯，罗军敏，覃明，姚新生【摘要 】 目的用鼠 CD25 分子胞外段基因疫苗免疫 Balb/c 小鼠，观察其诱导的体液免疫应答中 B 淋巴细胞的变化并探讨其意义。方法用 pcDNA3.1-CD25 胞外段真核表达质粒分别在第 0 天、第 10天和第 20 天肌肉注射免疫同系 Balb/c 小鼠，酶联免疫法(ELISA) 检测抗 CD25 胞外段的抗体水平及亚型，FACS 检测脾细胞中 B 淋巴细胞的比例变化及细胞因子 IL-4、IL-10 和 IFN-的表达变化。结果与对照组相比，CD25 胞外段基因免疫组小鼠血清
2、抗 CD25 抗体在免疫后逐渐升高，第 30 天达最高峰;抗 CD25 抗体主要以 IgG1为主; 免疫小鼠脾细胞中 B 细胞的比例变化不显著(P0.05)，但高分泌 IL-4 和 IL-10(P0.05)，而低分泌 IFN-(P0.05). IL-4 and IL-10 production of B cells in splenocytes from pcDNA3.1-CD25e immunized mice was higher than that in control group (P0.05). By contrast, IFN-production of B cells decre
3、ased significantly (P0.05).ConclusionCD25e DNA vaccine effectively induces the change in B cell function and provides foundation for further research on the role of humoral immune response in T cell vaccine.KEY WORDS: CD25 extracellular domain; DNA 3vaccination; B lymphocyte; T cell vaccineT 细胞疫苗 (T
4、 cell vaccine, TCV)作为一种治疗自身免疫病、病毒性疾病、器官移植排斥反应等的重要手段，目前在临床上得到大量的应用1-3。已有的研究发现，调节性 T 细胞和工作型抗原(ergotope)在 TCV 作用机制中发挥了重要作用4-8。然而，在TCV 的免疫调节效应中，其诱导体液免疫应答的相关国内外研究仍较少9。HERKEL 等10发现 TCV 在 Lewis 大鼠体内可以诱导针对T 细胞的 IgG 抗体。该抗体可以有效抑制 T 细胞的增殖。陈永良等11进一步报道 TCV 诱导的抗体可以与 T 细胞膜上多种成分结合。我们在新近的研究中利用小鼠 CD25 分子胞外段(extracell
5、ular domain)的基因免疫成功诱导了针对自体 CD25 胞外段的抗体，并有效抑制了后续自身免疫性肝损伤的发生12。这些研究均提示在TCV 诱导的免疫调节效应中，体液免疫反应也发挥了重要作用。因此，本研究中我们进一步观察 CD25 分子胞外段基因免疫后体液免疫应答中 B 细胞的比例和功能的变化情况，为后续深入研究体液免疫反应在 TCV 中的作用及其机制和后续临床推广应用提供基础。1 材料与方法1.1 材料 pcDNA3.1-CD25 胞外段质粒和 DH5为本实验室保存;CD25 胞外段蛋白由本室原核表达并纯化;质粒纯化试剂盒购自4TaKaRa 公司;HRP 标记兔抗鼠 IgG 抗体购自上
6、海未尔生物技术公司;HRP 标记兔抗鼠 IgA 抗体、HRP 标记兔抗鼠 IgG1 抗体和 HRP 标记兔抗鼠 IgG2a 抗体均购自上海未尔生物技术公司;PE 标记的抗小鼠 CD19 抗体购自 eBioscience 公司;FITC 标记的抗小鼠 IL-4、IL-10 和 IFN-抗体购自 eBioscience 公司;细胞固定和穿膜试剂购自eBioscience 公司;其他试剂均为分析纯级。1.2 实验动物 Balb/c 小鼠，H-2d 、 46 周龄、雌性，由重庆医科大学实验动物科学部提供，饲养于 SPF 级环境。1.3pcDNA3.1-CD25 胞外段疫苗肌注免疫小鼠将 6 周龄Bal
7、b/c 小鼠分为 PBS 对照组、pcDNA3.1 组和 pcDNA3.1-CD25胞外段组，每组 12 只，均肌注免疫。每次质粒 DNA 剂量100g，注射体积 100L，于 0、10、20d 免疫 3 次。免疫前收集小鼠血清，-70 冻存。1.4ELISA 法检测血清 IgA 和 IgG 及其亚型以前期原核表达纯化的 10mg/L CD25 胞外段蛋白包板， 4 过夜;以 50g/L 脱脂奶粉+PBS 封闭，37孵育 1h，用 PBS 洗涤 3 遍;加入 100L 110稀释血清，37 1h，洗 3 遍;加入 100L 11000稀释的 HRP-羊抗小鼠 IgG、HRP-羊抗小鼠 IgA、
8、HRP-羊抗小鼠 IgG1 或 HRP-羊抗小鼠 IgG2，37 1h，洗 5 遍;加入 100L OPD 底物，避光显色57min，加 50L 1mol/L H2SO4 终止显色，测 A450 值。1.5 流式细胞技术检测 B 淋巴细胞的比例末次基因免疫后7d，常规处死实验小鼠并收集脾细胞， PBS 洗涤后以 2106 细胞浓度重悬，取 100L细胞悬液，加入 PE 标记的抗鼠 CD19 抗体，4共育 30min，用 PBS 洗去游离的抗体重悬后用流式细胞仪检测B 淋巴细胞的比例变化。同时，加做抗体的同型对照。1.6 流式细胞技术检测 B 淋巴细胞的细胞因子末次基因免疫后 7d，常规处死实验
9、小鼠并收集脾细胞，PBS 洗涤后以 2106 细胞浓度重悬，取 100L细胞悬液，加入 PE 标记的抗鼠 CD19 抗体，4共育 30min，用 PBS 洗去游离的抗体重悬，经固定、穿膜和洗涤后，分别加入 FITC 标记的抗鼠 IL-4 抗体、IL-10 抗体或 IFN-抗体，4共育 30min，PBS 洗涤后用流式细胞仪检测 B 淋巴细胞的细胞因子表达情况。未与抗体作用的淋巴细胞作为空白对照。1.7 统计学处理数据以 s 表示，采用 SPSS12.0 统计软件进行方差分析，P0.05 为差异具有统计学意义。2 结果2.1CD25 胞外段基因免疫小鼠血清抗体水平的变化用6pcDNA3.1-CD
10、25 胞外段 (记为 pcDNA3.1-CD25)质粒基因免疫Balb/c 小鼠，免疫后间隔 10d 常规眼球采血，检测血清中抗 CD25胞外段抗体的水平。结果显示，与对照组相比，CD25 胞外段基因免疫组小鼠血清抗体水平显著增加(P0.05)，免疫 30d 后达到最高峰(P0.05)，随着时间的延长，抗体水平逐渐降低，免疫后80d，仍可以检测到抗 CD25 胞外段的抗体(图 1)。图 1pcDNA3.1-CD25 胞外段基因免疫小鼠血清中总 Ig 的水平 Fig.1 The curve of serum antibody specific to CD25e in pcDNA3.1-CD25e
11、 immunized micePBS：PBS 注射对照组;pcDNA3.1 ：pcDNA3.1空载体注射组;pcDNA3.1-CD25：pcDNA3.1-CD25e 注射组;与对照组相比，*P0.05。2.2CD25 胞外段基因免疫小鼠血清抗体的类型在此基础上，进一步检测基因免疫 30d 后小鼠血清抗体的类别。pcDNA3.1-CD25 胞外段基因免疫小鼠血清中抗 CD25 胞外段的抗体以 IgG 为主(P0.05)，并且主要是 IgG1 亚类(P0.05，图 3)。图 2pcDNA3.1-CD25 胞外段7基因免疫小鼠血清中 IgG 和 IgA 的水平(A)和 IgG 亚类的水平(B)Fig
12、.2 The serum level of IgG and IgA (A) and subclass of IgG (B) in pcDNA3.1-CD25e immunized miceA：IgG 与 IgA 浓度的比较，*P0.05;B：IgG1 与 IgG2a 浓度的比较， *P0.05。图3CD25 胞外段基因免疫小鼠脾细胞中 B 淋巴细胞的比例 Fig.3 The percentage of CD19+ B cells in splenocytes from pcDNA3.1-CD25e immunized micePBS：PBS 注射对照组;pcDNA3.1：pcDNA3.1 空载体注射组;pcDNA3.1-CD25e：pcDNA3.1-CD25e 注射组。2.4CD25 胞外段基因免疫小鼠脾细胞中 B 细胞的细胞因子分泌进一步检测了基因免疫后小鼠脾细胞中 B 细胞的细胞因子 IL-4、IL-10 和 IFN-的表达情况。pcDNA3.1 对照组中 B 细胞分泌细胞因子 IL-4 和 IL-10 的比例分别为(0.720.11)% 和(3.670.45)%，而 pcDNA3.1-CD25 胞外段基因免疫小鼠
