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1、1CCK8 对糖尿病大鼠胰岛细胞损伤保护相关蛋白质的实验分析作者：刘晓燕 李洪 李娟 王丽 段承刚 陶忠桦 何涛【摘要 】 目的 探讨八肽胆囊收缩素（CCK8 ）对糖尿病大鼠胰岛细胞损伤的保护作用。方法 检测 CCK8 对链脲佐菌素（STZ）致糖尿病大鼠模型的刺激前后血糖和血清胰岛素的水平，采用双向电泳并结合生物信息学方法，观察刺激前后胰腺组织蛋白质表达的差异。结果 初步确定了 CCK8 刺激引起胰岛细胞JIP1、 RBBP7、PP2AB、PDX1、BCLX 5 种蛋白质的表达明显增强，这些蛋白在促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、刺激胰岛素基因表达等方面发挥重要作用。结论 CCK8 可能通过刺激特异
2、蛋白质的表达，对糖尿病大鼠受损胰岛细胞起到一定的保护和恢复作用。 【关键词】 CCK8；糖尿病模型；胰岛细胞；蛋白质表达；大鼠胆囊收缩素（CCK ）是广泛分布于胃肠道及中枢和周围神经系统一种典型的脑肠肽，具有生物学功能的多样性，CCK8 是具有CCK 完全功能的最小活性片段，在种属间具有相对保守性。研究发现 CCK 有明显的刺激胰岛素分泌的作用，也是调节胰腺细胞再生的主要胃肠激素1，2 。近来的有关 CCK8 治疗 2 型糖尿病的研究2显示，CCK 及其类似物是极具潜力的 2 型糖尿病的治疗药物35 。但目前有关 CCK 对于糖尿病胰岛细胞损伤是否具有保护作用及其机制还知之甚少。本研究在建立糖
3、尿病大鼠模型的基础上，采用双向电泳等技术观察 CCK8 是否通过刺激特异性蛋白质的表达，进一步深化对 CCK8 胰腺保护作用的认识，拓展 CCK 及其类似物在 2 型糖尿病治疗中的应用提供实验依据。1 材料与方法1.1 动物及主要试剂SD 大鼠（重庆腾鑫生物技术有限公司） ；CCK8 和链脲佐菌素 (STZ)购自 Sigma 公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、超纯尿素、二硫苏糖醇、CHAPS、甘氨酸、甲基乙二胺(TEMED)、磷酸三丁酯(TBP)、过硫酸铵（APS） 、十二烷基磺酸钠（SDS ） 、固相 pH 梯度干胶条（pH 3 10，17 cm）和矿物油均购自 BioRad
4、 公司；枸橼酸钠购自中国上海试剂一厂；蛋白分子量 Marker 和苯甲基磺酰氟（ PMSF）购自碧云天生物技术研究所；125I胰岛素放射免疫试剂盒购自北京普尔伟业生物科技有限公司。1.2 实验方法31.2.1 分组及糖尿病模型的建造SD 大鼠 68 只，随机分为正常对照组和糖尿病模型组。糖尿病模型组大鼠禁食 10 h，按 55 mg/kg 腹腔内注射 STZ 溶液（用0.1%无菌枸橼酸钠缓冲液新鲜配制成 2%溶液，调 pH=4.5，过滤除菌） 。1.2.2 CCK8 的注射随机取对照组和糖尿病模型组大鼠各 30 只，腹腔内分别注射生理盐水 0.1 ml 或 10-6mol/L CCK8 0.1
5、 ml，于 1、2 及 3 d后各时间点处死大鼠 10 只，取血清及胰腺组织 -80冻存待用。1.2.3 血清胰岛素及血糖的测定各组血清胰岛素浓度采用 125I放射免疫法进行检测。各组SD 大鼠于造模前后和给药前后采用血糖仪（德国罗氏诊断公司）检测尾静脉血血糖浓度。1.2.4 蛋白样品的制备4取 50 mg 胰腺组织加入 300 l 裂解液（8 mol/L 尿素+0.2%Biolyte+0.1%CHAPS+15 l PMSF） ，剪刀剪碎并用小圆头玻棒研磨，冰上裂解 30 min，12 000 r/mim 离心 60 min。取上清液用 Bradford 法测蛋白浓度，分装，-80 冻存。1.
6、2.5 蛋白质组双向电泳分离分别取各组蛋白样品 800 mg，加水化液（裂解液+DTT 0.01 g/L+Biolyte 5 l/ml+0.1%溴酚蓝 10 l）至总量 300 l/胶条，混匀后加入水化槽，将胶条放置 1 h 后加入矿物油覆盖过夜。将水化后的胶条转移至等电聚焦电泳系统(BioRad) ，于 17进行聚焦，程序设置为 250 V，30 min 1 000 V，1 h 10 000 V，5 h 10 000 V，6 h 250 V，2 h，总伏时数约为 8 万伏时。取出胶条，加入平衡液（6 mol/L 尿素+2SDS+20甘油+0.375 mol/L TrisHCl，pH=8.8
7、）+20%DTT，平衡 15 min；再将胶条小心放于 10%分离胶顶端，用 0.5%的琼脂糖（含少量溴酚蓝）封闭胶条进行第二向 SDSPAGE 电泳，电泳参数为 10 mA/胶条，1 h；以后为 20 mA/胶条。待溴酚蓝接近分离胶底端时停止电泳。1.2.6 考马斯亮蓝染色 按常规方法进行。1.2.7 凝胶成像及双向电泳图谱分析5将染色后的凝胶置 ChemiDoc XRS 凝胶成像系统(BioRad)中照相成像。采用 ImageMaster 2D Platinum(Amersham)双向电泳图谱分析软件进行斑点自动识别、定量检测及匹配对比分析。获得各蛋白斑点的实验等电点（pI）和分子量（MW
8、） ，结合组织表达特异性，采用 TagIdent 工具软件检索 SWISSPROT 蛋白数据库，对蛋白斑点进行初步鉴定。1.3 统计学分析数据用 xs 表示，组间比较采用 t 检验。采用 SPSS11.0 统计软件分析处理数据。2 结 果2.1 大鼠糖尿病模型的建立经注射 STZ 造模后，大鼠尿量、食量、饮水明显增加，体重明显减轻，餐后血糖浓度明显增高，而血清胰岛素浓度明显降低，说明大鼠糖尿病模型造模成功。正常对照组及糖尿病模型组CCK8 刺激前后大鼠血糖及血清胰岛素浓度的变化。见表 1。表 1 CCK8 刺激前后餐后血糖和血清胰岛素的变化( 略)62.2 大鼠胰腺组织蛋白质组的双向电泳分别提
9、取正常对照组及糖尿病模型组 CCK8 刺激前后大鼠胰腺组织蛋白质组进行双向电泳并经考马斯亮蓝染色，所获得的典型的双向电泳图谱。经 ImageMaster 2D Platinum 分析软件进行斑点自动识别和检测，在 pI 3.010.0，MW 19.7174.4 kD 的范围内，共检出蛋白质斑点 226 个(“+”标示)。见图 1。2.3 典型蛋白质斑点的初步确定选取具有表达差异的蛋白质斑点(即斑点的相对总灰度值%Vol1.0 倍 )，根据其实验 pI 值和 MW，结合其组织表达特异性，匹配检索 SWISSPROT 数据库(http:/www.expasy.org/) 及SOURCE 组织细胞表
10、达数据库(http:/smd.stanford.edu/cgibin/source/sourceSearch)，初步确定了与 CCK8 刺激大鼠糖尿病模型组相关的 5 种蛋白质。见图1，表 2。表 2 初步确定的 CCK8 刺激大鼠糖尿病模型组表达增高的蛋白质(略 )3 讨 论STZ 对一定种属动物的胰岛 细胞具有选择性的破坏作用，从而7使许多动物产生糖尿病。本研究采用注射 STZ 人工造模的方法，获得了大鼠糖尿病模型。经大鼠血糖及血清胰岛素浓度测定，餐后血糖浓度增高而血清胰岛素浓度降低，证实造模成功。给予 CCK8刺激后，虽然血糖浓度改变不大，但血清胰岛素浓度有轻微升高趋势，说明 CCK8
11、可能对受损胰岛细胞有一定的保护和恢复作用。为了进一步从分子水平上观察 CCK8 对受损胰岛细胞的保护和恢复作用，本实验采用外源性给予糖尿病大鼠模型 CCK8，2 d 后取胰腺组织进行双向电泳，并与蛋白质生物信息数据库及组织细胞特异表达数据库进行匹配分析，初步确定了 5 个在 CCK8 刺激前后存在明显表达差异的蛋白质，即 cJun 氨基末端激酶作用蛋白1(JIP1)、组蛋白结合蛋白 RBBP7(RBBP7)、丝/ 苏蛋白磷酸酶 2A 催化亚基 亚型(PP2AB)、胰腺/十二指肠同源盒蛋白 1(PDX1)和凋亡调节蛋白 BclX(beta)(BCLX)。JIP1 是一种在胰岛 细胞中特异表达的蛋
12、白质，具有选择性调节 JNK 和 MAPK 信号转导途径，直接或间接地调控 GLUT2 基因表达和 细胞的生理功能，并且作为抗凋亡蛋白，调节胰岛 细胞的凋亡和存活6，7 。BCLX 也是一种分布广泛的凋亡调节蛋白，具有抑制细胞凋亡的作用。RBBP7(RbAp46)在胰腺中高表达，具有调节组蛋白乙酰转移酶和去乙酰转移酶组蛋白底物，不同程度调节染色质代谢复合物组件，促进组蛋白脱乙酰作用和转录抑制的组蛋白8脱乙酰核复合物，促进基因表达和蛋白质合成，促进细胞生理功能的恢复8 。PP2AB 大部分分布于胰腺，能调节 CCK 受体的敏感性9 ，以及磷酸化激酶 B、酪蛋白激酶 2、促有丝分裂 S6 激酶和M
13、AP2 等信号转导相关蛋白激酶或蛋白磷酸酶的活性，从而对相应的信号转导通路产生影响10 。PDX1 是一种特异地分布于胰腺和十二指肠的基因表达调节蛋白，能结合 DNA 序列 5CCCTTAATGGG3，启动胰岛素基因的表达，是激活胰岛和胃肠道肽类激素表达的关键调节蛋白11，12 。已观察到 CCK8 和胃泌素能通过作用于 CCKB 受体而促进 PDX1 的表达5 。因此，CCK8对胰岛细胞的保护或恢复作用，可能是通过促进特异性蛋白质表达增强，进而促进 DNA 复制、蛋白质表达及细胞增殖；抑制胰岛细胞凋亡；调节基因表达，特别是胰岛素基因的表达，增加肽类激素的合成等方面来发挥其作用的。这一发现为临
14、床联合应用 CCK8治疗 2 型糖尿病提供了新的实验依据。本研究通过双向电泳及生物信息学分析，初步确定了 5 种与CCK8 刺激糖尿病大鼠胰岛细胞损伤保护相关的蛋白质，但这些蛋白质的进一步确证尚需采用 Western 印迹和质谱分析等技术方法加以鉴定。【参考文献】1 魏立民 .胆囊收缩素与糖尿病 J.国外医学内分泌学分册，92003；23(6)：41921.2 魏立民，朱铁年，史英钦，等. 八肽胆囊收缩素对体外胰岛素 细胞增殖及胰岛素分泌的影响 J.中国老年学杂志， 2005；25(9)：10756.3 Ahrn B，Holst JJ，Efendic S.Antidiabetogenic ac
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16、dermal growth factor and gastrin induces neogenesis of human islet betacells from pancreatic duct cells and an increase in functional betacell massJ.J Clin Endocrinol Metab，2005;90(6)：340109.6 Bonny C，Oberson A，Negri S,et al.Cellpermeable peptide inhibitors of JNK：novel blockers of betacell 10deathJ.Diabetes，200
