《Cav1.3 L型钙通道K228E突变体的构建及功能研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Cav1.3 L型钙通道K228E突变体的构建及功能研究（15页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1Cav1.3 L型钙通道 K228E 突变体的构建及功能研究作者：强华，孙超峰，魏 峰，张爱峰，史瑞明，马爱群，崔长琮【摘要 】 目的 通过构建 Cav1.3 基因 K228E 突变，观察 K228E突变对 L型钙通道电生理特性及蛋白表达和转运的影响。确定钙通道 1 亚基结构域S4 段上 N端带正电荷的氨基酸对该通道电生理学特性的作用，从而为创建钙通道起搏器奠定基础。方法 一步法快速定点诱变构建 Cav1.3 基因 K228E 突变体的真核表达载体;膜片钳观察突变钙通道电流，激光共聚焦技术观察突变钙通道蛋白在细胞内的表达和定位。结果 检测表达于 HEK293 细胞上的 L型钙电流：转染野生型
2、 Cav1.3 质粒和相关亚基质粒，可检出 L型钙电流，其半激活电压 V1/2=(-36.562.08)mV、半失活电压V1/2 =(-42.930.14)mV(5mmol Ba2+);而转染 K228ECav1.3质粒和相关亚基质粒的 HEK293T 细胞上未检测到钙电流 ; 检测K228E 突变通道蛋白在细胞内的表达和定位：转染野生型和突变型Cav1.3 质粒及相关亚基质粒，48h 后观察到野生型与突变型钙通道蛋白在细胞膜上都有表达。结论 Cav1.3 基因 K228E 突变虽不影响L型钙通道蛋白质的表达与转运，但却不表达钙通道电流，是一种功能丧失性突变。 2【关键词】 生物起搏;Cav1
3、.3;L 型钙通道; 定点诱变;膜片钳ABSTRACT: Objective The study is to construct the K228E mutation of Cav1.3 and evaluate its effect on electrophysiological characteristics and protein expression and transport of Ltype calcium channel. The effect of amino acid with positive charges in Nterminal of segment S4 of Ca
4、v1.3 on electrophysiological characteristics of Ltype calcium channel is also investigated so as to create a calcium channel pacemaker. Methods The eukaryotic expression vector for K228ECav1.3 mutant was constructed by rapid sitedirected mutagenesis; Ca2+ current was measured by patchclamp technique
5、; the expression and subcellular localization of Ca2+ channel protein were observed by laser confocal microscopy. Results Patchclamp recordings of Ca2+ current: There was obvious current from HEK293T cells transfected with pCDNA6WTCav1.3 and related subunit, V1/2 from steady stateactivation curve wa
6、s (-36.562.08)mV; V1/2 from steady stateinactivation curve was (-42.930.14)mV (5mmol/L Ba2+). However, there was no current from HEK293T cells transfected with pCDNA6K228ECav1.3 and related subunit. The 3expression and subcellular localization of Ca2+ channel protein: 48 hours after the HEK293T cell
7、s were transfected with WTCav1.3 or K228ECav1.3 plasmids, both the channel protein of WTCav1.3 and K228ECav1.3 were expressed on cell membrane surface. Conclusion The K228E mutation of Cav1.3 channel has no effect on the protein expression and transport of Ltype calcium channel. It is a functional l
8、oss mutation which has no expression of Ca2+ current.KEY WORDS: biological pacemaker; Cav1.3; Ltype calcium channel; fixedpoint mutation; patch clamp以病态窦房结综合征为主的缓慢型心律失常在临床上并不少见，永久型人工起搏器植入是目前治疗有明显症状的缓慢型心律失常患者最有效的方法，但由于其存在着不少缺点，如起搏器缺乏对神经体液调节的反应性、电池能量的有限性以及感染、血栓等1，因此，国内外有学者试图寻找生物起搏的方法，以期达到生理性起搏的目的。生物起搏
9、的核心是选择一种合适的离子通道编码基因作为导入基因。由于用野生型基因构建的生物起搏，其起搏频率适应生理变化的灵活性不足2，所以有必要通过分子生物学技术，将野生型离子通道的个别基因进行突变，改变该离子通道的功能，从而构建一个新的起搏基因。Cav1.3 L型钙通道在窦房结细胞起搏中起着重4要的作用3。如果对该通道的编码基因进行重构，改变其电压激活特性，将其去极化激活改为超极化激活，或将其激活阈值下调(-90mV)，有望构建出一个适合起搏的离子通道。本文对钙通道 1亚基结构域S4 段上 N端带正电荷的氨基酸对该通道电生理特性的作用进行了探索性研究。1 材料与方法1.1 材料 携带全长鼠 Cav1.3
10、 基因(GenBank：AF370009)、Cav3 基因和 Cav2 基因的质粒pcDNA6Cav1.3、pcDNA3.1Cav3 和 pcDNA3.1Cav2 由美国 Brown 大学 LIPSCOMBE D 教授惠赠，质粒 pRK5GFP 由美国 Wisconsin 大学 ANSON BD 博士惠赠。大肠杆菌 Top10 由我室保存。HEK293T 细胞株购自中国典藏培养物保存中心。去内毒素超纯质粒中量提取试剂盒购自美国 Omega 公司。基因突变试剂盒QuikChangeXL SiteDirected Mutagenesis Kit 购自美国Stratagene 公司。转染试剂 Lip
11、ofectamineTM 2000 购自美国Invitrogen 公司。Cav1.3 抗体购自以色列 Alomone Labs。其他试剂均为进口或国产分析纯。1.2 方法51.2.1 Cav1.3K228E 突变体的构建 我们拟将 Cav1.3L型钙通道 1 亚基结构域S4 段中第一个带正电荷的碱性氨基酸 赖氨酸(K228)诱变为带负电荷的酸性氨基酸 谷氨酸(E) 。根据QuikChange XL SiteDirected Mutagenesis Kit 的要求，我们设计引物如下(将第 682 位碱基 AG)：5GGAGGCTTTGATGTCGAAGCCCTCCGTGCC3;3CCTCCGAA
12、ACTACAGCTTCGGGAGGCACGG5。按照试剂盒的说明进行操作。提取质粒后，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆并将突变结果送北京奥科生物技术有限责任公司测序。1.2.2 转染 HEK293T 细胞 HEK293T 细胞在含 100mL/L 胎牛血清的 DMEM 培养基中培养。转染前 1d，细胞铺板在 500L 含血清、不含抗生素的正常生长的 DMEM 培养基中(24 孔板)，使其在转染日密度为 50%60%。转染质粒 pcDNA6WTCav1.3(或pcDNA6K228ECav1.3)、pcDNA3.1Cav3 、pcDNA3.1Cav2 和 pRK5GFP 质粒基因(荧光标记)的比例为33
13、31。采用 LipofectamineTM 2000 脂质体转染法，每孔细胞用 18.75L 无血清培养基稀释 0.3g 质粒和 0.75L LipofectamineTM 2000，按试剂盒操作步骤进行。转染后放入637、50mL/L CO2 培养箱，培养 48h 后进行实验。1.2.3 基因转染 HEK293T 细胞的通道电流测定 HEK393T 细胞在转染后 48h，经胰酶消化成单细胞悬液，4h 内进行全细胞膜片钳实验。膜片钳放大器为 Axon700B 单探头膜片钳放大器( 美国Axon 公司)，数据采集由 Clampex9.2 完成 (美国 Axon 公司)。玻璃毛细管(北京正天易科贸
14、有限公司) 用 p97 微电极拉制仪(美国SUTTER INSTRUMENT 公司) 拉制，冲灌电极内液后的电阻阻抗为25M。记录钙通道电流时采用的电极外液成分(mmol/L)：Choline Cl 135，MgCl2 1，BaCl2 5，HEPES 10，用 CsOH 调至pH 7.4;电极内液成分(mmol/L)：CsCl 135，EDTA 1，EGTA 1，MgATP 4，HEPES 10，用 CsOH 调至 pH 7.4。采样参数设置方案(Protocol)：ICaL 电流 电压(-)曲线测定：在电压钳模式下，钳制电压-100mV，指令电压去极化自-80mV 至+60mV，阶跃是 10
15、mV，每一个指令电压维持时间是300ms，刺激频率 0.5Hz。加用 P/4 漏减。以各刺激电位下电流峰值相对值与相对应电位作-曲线图。ICaL 激活曲线测定：采用上述同样方法，将指令电压改为去极化自-80mV 至-10mV ，记录到 ICaL 激活电流，以电流相对值对条件刺激电压作 ICaL 激活曲线图并按 Boltzmann 方程进行拟合，求得半激活电压。ICaL稳态失活曲线的测定：设定钳制电压为-80mV，施于 1000ms、阶7跃为+10mV、去极化自-80 至+10mV 的系列条件脉冲刺激，在每一条件脉冲后紧跟一固定除极至 0mV、150ms 的测试脉冲，记录ICaL，之后电位降至
16、-80mV。以电流相对值对各条件刺激电压作ICaL 失活曲线图，并经 Boltzmann 方程进行拟合，求得半失活电压。1.2.4 细胞免疫荧光检测 Cav1.3 L型钙通道蛋白的表达 24孔板中放入预先经明胶处理过的盖玻片，将对数生长期的 HEK293T细胞铺于板上，继续生长 12h。将 pcDNA6WTCav1.3(或pcDNA6K228ECav1.3)、pcDNA3.1Cav3 和 pcDNA3.1Cav2 按照 111 的比例进行转染，48h 后吸弃培养液， 40g/L 多聚甲醛固定15min，PBS 洗 3 遍后，3mL/L 的 Triton X100 室温下打孔15min，山羊血清封闭 30min;一抗 Cav1.3 抗体(12
