《Calphostin C抑制酶修饰低密度脂蛋白诱导的内皮单核细胞黏附》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Calphostin C抑制酶修饰低密度脂蛋白诱导的内皮单核细胞黏附（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1Calphostin C 抑制酶修饰低密度脂蛋白诱导的内皮 单核细胞黏附作者：王中群 崔静 李丽华 赵卫星 赵琪 苏蔚 申虎 位冒冒【摘要 】 目的 探讨酶修饰的低密度脂蛋白(ELDL) 诱导内皮 单核细胞黏附的机制及 Calphostin C 的干预效果。方法 采用体外培养和直接计数法观察荷脂 ECV304 内皮细胞黏附能力的变化；PepTagRAssay 法定性内皮细胞胞膜蛋白激酶 C(PKC)活性状态；RTPCR 和 Western 印迹检测细胞间黏附分子1(ICAM1) 和抑制性蛋白 B(IB)表达的变化。结果 ELDL 呈剂量依赖性增强内皮 单核细胞间的黏附，其活化内皮促进黏附的理
2、想剂量为 2040 g/ml 浓度。另外，ELDL 还可显著活化内皮细胞胞膜 PKC，下调IB 的表达而增强 ICAM1 的表达。应用 PKC 特异性抑制剂Calphostin C 干预后，荷载 25 g/ml ELDL 8 h 的 ECV304 内皮细胞 ICAM1 表达下调而 IB 则反相上调，黏附能力也在Calphostin C 达到 100 nmol/L 浓度时显著下调，细胞状态明显好转；且 200400 nmol/L Calphostin C 基本可以逆转 ELDL 对内皮细胞的影响。结论 内皮细胞黏附能力的强效促进剂 ELDL 可能是通过 PKC/NFB/ICAM1 发挥作用的，针
3、对 PKC 靶酶的特异性抑制剂 Calphostin C 可以有效地抑制由 ELDL 引起的内皮活化黏附增强。 2【关键词】 Calphostin C；低密度脂蛋白，酶修饰；细胞间黏附分子1 ；黏附；内皮细胞单核细胞与血管内皮细胞、平滑肌细胞的黏附是动脉粥样硬化性心脑血管病的重要早期事件1 ，探讨病理状态下细胞与细胞间的黏附机制，并进而采取相应的干预措施，尤其是早期的药物干预，将会有效地预防该类疾病的发生。为此，本研究拟在课题组前期高脂血症影响内皮功能、促进脂纹和斑块形成的基础上2 ，以酶修饰的低密度脂蛋白(ELDL) 处理 ECV304 人脐静脉内皮细胞，观察其黏附能力及相关指标，细胞间黏附
4、分子1(ICAM1) 、抑制性蛋白 B(IB)和蛋白激酶 C(PKC)的改变，并进而以 PKC 的特异性抑制剂 Calphostin C 进行相应干预，试图为黏附干预药物的体外研究奠定基础。1 材料与方法1.1 材料与试剂 THP1 单核细胞和 ECV304 脐静脉内皮细胞(购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库)；Calphostin C(购自 Biomol 公司)。总 RNA 提取试剂盒 TRIzol(购自上海 Sangon 公司)； ImPromIITM Reverse Transcriptase、PepTagRNonRadioactive PKC Assay Kit 和 BCATM
5、Protein Assay 3Kit(购自 Promega)；MasterMix 一管便捷式 PCR 扩增试剂盒( 购自北京天为时代)；所有引物( 由上海生工生物工程服务有限公司合成) ；IB 和 ICAM1 一抗， Western 印迹 Luminol Reagent(购自Santa Cruz)；辣根过氧化物酶标记二抗(购自武汉博士德生物工程有限公司)；其他试剂均为进口或国产分析纯。1.2 低密度脂蛋白(LDL) 的分离、酶修饰及鉴定 参考文献3的方法制备 ELDL。取新鲜人血浆 100200 ml，加入 PDB 以防腐抗氧化。置超速离心机作序列超速离心。提纯的 LDL 在含 200 mol
6、/L EDTA 的磷酸缓冲液 (PBS)液中透析 48 h 后，加入胰蛋白酶(6.6 g/ml)和胆固醇脂酶(40 g/ml)共孵育 48h 后，获得ELDL。BCA 法蛋白定量，鉴定后过滤除菌，调蛋白浓度至 1 g/L， 4 保存，1 w 内使用。1.3 实验分组 本研究分为两个部分，首先以 ELDL 浓度梯度(0、5、10、20、40 g/ml)处理 ECV304 内皮细胞 8 h。在观察到内皮细胞黏附功能和胞膜 PKC 活性的变化后，为了进一步明确ELDL 诱导黏附的可能机制以及 PKC 和黏附的关系，遂以 PKC 的特异性抑制剂 Calphostin C 处理荷载 ELDL 的 ECV
7、304 内皮细胞。分组情况：25 g/ml ELDL +10 l DMSO 孵育细胞 8 h； 25 g/ml ELDL+25 nmol/L Calphostin C 孵育细胞 8 h； 25 g/ml ELDL+50 nmol/L Calphostin C 孵育细胞 8 4h； 25 g/ml ELDL+100 nmol/L Calphostin C 孵育细胞 8 h； 25 g/ml ELDL+200 nmol/L Calphostin C 孵育细胞 8 h； 25 g/ml ELDL+400 nmol/L Calphostin C 孵育细胞 8 h。加入处理因素后每组细胞均在距 20 W
8、 Philip 荧光灯 10 cm 处照射大约 30 min，以激活 CalphostinC 的药物活性。1.4 细胞黏附实验 参考文献4并加以改进。向生长于 24 孔板并融合至 80%的 ECV304 细胞中分别加入上述处理因素培养 8 h后，加入 4106 个/mlTHP1 单核细胞悬液 800 l/孔，37 孵育 30 min，吸弃培养基，预热 PBS 洗 2 次去除未黏附细胞，4% 多聚甲醛固定细胞，显微镜 计算机图像分析系统计数黏附细胞，方法为每个孔分别计数上、中、下、左、右每个视野的 ECV304 和THP1 细胞数，5 个视野单核细胞数/内皮细胞平均后即得到各个孔每个视野每个 E
9、CV304 内皮细胞黏附的 THP1 单核细胞数目。试验重复 3 次。内皮细胞的黏附能力 (Adhesion ability)用每个内皮细胞黏附的单核细胞数目来表示。1.5 PepTagRAssay 参照文献5进行。将经过处理 8 h 的ECV304 细胞分别提取胞浆胞膜蛋白。BCA 蛋白检测试剂盒定量后按照 PepTagRAssay Kit 说明进行如下操作。取 9 l 胞膜蛋白粗提液加入到 16 l 经过 30 2 min 的 PKC 活性检测反应液，混匀后构成 25 l 的反应体系 (阴性对照则将 9 l 未变性胞膜蛋白的粗提5液替换为 9 l 去离子水 )；30 30 min，95 1
10、0 min。4避光保存。取 5 l 反应终产物 0.8%的琼脂糖凝胶 100 V 的电压条件下水平电泳 15 min。终止电泳后 UVP 凝胶电泳分析系统摄像，显示胞膜 PKC 磷酸化与非磷酸化条带。1.6 逆转录聚合酶链反应 RTPCR 用 TRIzol 试剂提取经过 1.3处理细胞的总 RNA，溶于无 RNA 酶水中，紫外分光光度计测定OD260/OD280 的比值在 1.82.0 之间。取总 RNA 2 g，用ImPromIITM Reverse Transcriptase 合成 cDNA，再取逆转录产物 10 l 进行 PCR 循环。ICAM1 引物序列5CAGTCACCTATGGCA
11、ACGAC3(正义)，5ATTCAGCGTCACCTTGGCTC3(反义) ，243 bp；actin 引物序列 5ATCCCTGTACGCCTCTGG3(正义)，5TCCTTCTGCATCCTGTCG3(反义),500 bp。PCR 反应条件为：95 5 min 预变性，95 30 s 变性，60 30 s 退火，72 1 min 延伸，35 个循环， 72 5 min 继续延伸。IB 引物：5CGTTCCTGCACTTGGCCATC3(正义)，5GTCCGGCCATTACAGGGCTC3(反义 )；94 30 s，55 45 s，72 1 min,共 32 个循环，409 bp。反应结束后
12、，取 RTPCR产物在 1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，加样量均为 10 l，溴化乙锭染色。电泳条带采用 UVP 凝胶图像分析系统做积分吸光度测定和分析，以各组目的基因与内参照基因吸光度值的比值来比较待测基因6mRNA 的表达差异。1.7 Western 免疫印迹检测 提取经过处理的细胞总蛋白，BCA蛋白定量并煮沸变性后，参考文献6 进行 IB 和 ICAM1 的蛋白免疫印迹检测。蛋白条带采用 UVP 凝胶图像分析系统分析。以对照组的面积灰度值为 100%，与实验组进行比较和半定量分析。1.8 统计学处理 数据用 xs 表示，组间比较采用方差分析及 t检验，由 SPSS11.0 统计软件完成。2
13、结 果2.1 ELDL 增强内皮 单核细胞的黏附 倒置生物光学显微镜下可见未加处理因素的对照组内皮细胞呈胖梭形铺路石样外观，单核细胞小圆形、透亮，生长状态良好。用 ELDL37 孵育 8 h 后，ECV304 内皮细胞黏附的单核细胞数目明显增加；细胞计数显示ELDL 呈剂量依赖性的方式增强内皮 单核细胞的黏附。由表 1 可见：随着 ELDL 浓度由 0 上升到 20 g/ml，内皮细胞的黏附能力也增加了 2.5 倍；但 20 g/ml ELDL 处理组与 40 g/mlELDL处理组内皮细胞的黏附能力差异不显著(P0.05)，显示该浓度的处理已使内皮细胞的黏附能力进入到了一个相对稳定的平台期。
14、72.2 ELDL 促进内皮细胞 PKC 的活化 随着 ELDL 浓度的增加，ECV304 内皮细胞 PKC 活性的磷酸化区带亮度越来越强。不过在20 g/mlELDL 处理组与 40 g/mlELDL 处理组内皮细胞 PKC活性基本趋于稳定(图 1)。2.3 ELDL 影响黏附相关因子 IB 和 ICAM1 的表达 ELDL抑制 IB mRNA 的表达(呈剂量依赖性的方式)，促进ICAM1mRNA 的表达(图 2，表 1)。但在 5、10 和 20 g/ml ELDL 处理组间 ICAM1mRNA 的表达差异不显著(P0.05) 。Western 印迹结果显示 ELDL 处理对 ECV304
15、 内皮细胞 IB 和ICAM1 表达影响的整体趋势与 RTPCR 结果基本吻合。2.4 Calphostin C 抑制荷载 ELDL 内皮细胞黏附能力的增强 倒置生物光学显微镜下可见随着 Calphostin C 浓度的增加，荷载 25 g/mlELDL 8 h 的 ECV304 内皮细胞开始由瘦梭形转变为胖梭形，胞浆内脂滴等异常物质的蓄积也开始减少。当 Calphostin C 浓度增至 100 nmol/L 时，黏附单核细胞的能力明显降低(表 2)，细胞状态也明显好转；当 Calphostin C 浓度增至 400 nmol/L 时，内皮细胞的黏附能力基本被逆转至未荷载 ELDL 的基线水平之下(P0.01)(图 3，表 1 和表 2)。2.5 Calphostin C 抑制 ELDL 对 IB 和 ICAM1mRNA 影响 8随着 Calphostin C 浓度的增加，荷载 25 g/mlELDL 8 h 的ECV304 内皮细胞 IB mRNA 的表达上调，ICAM1 mRNA 表达下调，而且这种上调或下调在 200400 nmol/L CalphostinC 时基本趋于稳定，25 g/ml ELDL+200 与 400 nmol/L CalphostinC
