《Calphostin C对乳腺癌细胞增殖的抑制作用及相关机制》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Calphostin C对乳腺癌细胞增殖的抑制作用及相关机制（16页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1Calphostin C 对乳腺癌细胞增殖的抑制作用及相关机制作者：千新来，崔静，任峰，赵杰，冶亚平，贺国洋，李新强，朱慧芳，韩芳毅，杨慧林，王霞，原志庆【摘要 】 目的 研究 Calphostin C 对乳腺癌细胞MDAMB435S 增殖的影响及初步机制。方法 通过观察Calphostin C 处理 MDAMB435S 细胞前后细胞的生长速度、倍增时间、克隆形成率和细胞周期分布等变化，探讨 Calphostin C对 MDAMB435S 细胞增殖的影响；通过 Western blotting、免疫细胞化学染色和 RTPCR 等方法探讨 Calphostin C 影响MDAMB435S 细胞
2、增殖的初步机制。结果 与 MDAMB435S亲本细胞(对照组 )相比， Calphostin C 处理的 MDAMB435S 细胞(实验组 )生长速度明显减慢，倍增时间明显延长(P0.01)，并且呈现浓度和时间依赖性；对照组和实验组细胞克隆形成率分别为(82.336.81)%和(22.001.73)%，差异有统计学意义(P0.01)；实验组细胞周期出现明显的 G1 期阻滞(P0.01)。Western blotting 和免疫细胞化学染色结果显示，与对照组细胞相比，实验组细胞中蛋白激酶 C(protein kinase C, PKC)表达没有明显变化，但活性状态(胞质转位至胞膜) 的 PKC
3、显著减少。Western blotting 和 RTPCR 结果显示，与对照组细胞相比，实验组细胞中2p53、Cyclin A 和 Cyclin B 表达没有明显变化，但 p21 表达上调，Cyclin E 表达下调。结论 Calphostin C 可显著抑制乳腺癌细胞MDAMB435S 的增殖，该作用可能与其抑制 PKC 活性、上调p21 表达和下调 Cyclin E 表达有关。 【关键词】 钙磷酸蛋白 C；蛋白激酶 C；乳腺癌；增殖China)ABSTRACT: Objective To explore the effects of Calphostin C on the prolifer
4、ation of breast carcinoma cells (MDAMB435S) and its preliminary mechanism. Methods The effects of Calphostin C on the proliferation of MDAMB435S cells were studied by observing changes of the growth rate, doubling time, cloneforming efficiency, and distribution of cell cycle of MDAMB435S cells befor
5、e and after Calphostin C treatment. Furthermore, the mechanism involved was analyzed by Western blotting, immunocytochemistry and RTPCR assay. Results Compared with those of the parental MDAMB435S cells (control group), the growth rate was suppressed markedly and the doubling time was prolonged sign
6、ificantly (P0.01) in the MDAMB435S cells treated with Calphostin C (experimental group), and the changes presented concentration and 3timedependence patterns. Furthermore, the cloneforming efficiency in control group and experimental group was (82.336.81)% and (22.001.73)%, respectively, with a sign
7、ificant difference (P0.01). Moreover, for the experimental group cells, the cell cycle arrested in G1 phase (P0.01). The results from Western blotting and immunocytochemical staining indicated that compared with that of the parental MDAMB435S cells, the expression of protein kinase C (PKC) did not c
8、hange significantly, but PKC in active status (transposition from cytoplasm to cytomembrane) was decreased dramatically in the MDAMB435S cells treated with Calphostin C. Western blotting and RTPCR results showed that compared with that of the parental MDAMB435S cells, the expression of p53, Cyclin A
9、 and Cyclin B had no significant changes, while the expression of p21 was increased and the expression of Cyclin E was decreased in the MDAMB435S cells treated with Calphostin C. Conclusion Calphostin C could suppress markedly the proliferation of MDAMB435S cells, which may be correlated to the abil
10、ities of inhibiting PKC activity, upregulating the expression of p21 and downregulating the expression of Cyclin E.4KEY WORDS: Calphostin C; protein kinase C; breast carcinoma; proliferation肿瘤细胞过度增生与有丝分裂信号途径相关基因过度表达密切相关，而蛋白激酶 C(protein kinase C, PKC)的过度激活在后者中起重要作用1，提示 PKC 的过度激活可能与肿瘤的发生发展有关。越来越多的证据显示
11、,多种肿瘤( 如乳腺癌、恶性神经胶质瘤等 )组织中 PKC 的表达和活性都远高于相应的正常组织 2。因此，PKC是一个潜在的有价值的抗肿瘤治疗靶点1。PKC 特异抑制剂钙磷酸蛋白(Calphostin)是一类菌类分支孢子菌属分子孢子提取物，以Calphostin C 最具代表性34 。乳腺癌的发生率在世界范围内仍呈上升趋势，我国乳腺癌发生率增加速度(3%5%)明显高于世界平均水平(1.5%)5 。鉴于以上研究及国内、外尚未见 Calphostin C对乳腺癌作用的相关报道，本研究拟以乳腺癌细胞MDAMB435S 为研究对象，探讨 Calphostin C 对乳腺癌细胞增殖的影响和初步机制。1
12、材料与方法1.1 材料51.1.1 主要试剂Calphostin C 为美国 Calbiochem 公司产品；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)为杭州四季青公司产品；逆转录 聚合酶链反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction, RTPCR)试剂盒、 Taq DNA 聚合酶和 dNTPs 等为美国 Promega公司产品；Trizol 试剂、蛋白分子量标准、 100bp DNA Markers和 DMEM/F12 培养基等为美国 Invitrogen 公司产品；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DM
13、SO)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和吉姆萨染料等为美国 Sigma 公司产品；DBA 试剂盒和增强化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)试剂盒购自中杉生物技术有限公司；PKC 鼠抗人单克隆抗体和通用型 PV6000 两步法免疫细胞化学试剂盒为美国 Zymed 公司产品；Cyclin E 兔抗人多克隆抗体、p21 和 actin 鼠抗人单克隆抗体为美国 Santa Cruz 公司产品。PCR 引物由上海生物工程有限公司合成(表 1)。表 1 引物序列和目的片段（略）1.1.2 细胞系及培养条件乳腺癌细胞系 MDAMB435S 购于中国科学院上海细胞库，培养条件为
14、含 100mL/L FBS 和青/ 链霉素(青霉素 100u/mL、链霉素 100mg/L)的 DMEM/F12 培养基，于 37 、50mL/L CO2 孵6箱中培养。1.1.3 Calphostin C 的配制用 DMSO 溶解 Calphostin C，配制为 100mol/L，-20避光保存备用。1.2 方法1.2.1 生长速度和倍增时间的检测取对数生长期 MDAMB435S 细胞接种 24 孔板(2104/孔)，常规培养 24h 后，更换为含不同浓度 Calphostin C(0.05、0.10、0.25、0.50nmol/L 和 1.00nmol/L)的培养基，设不加药组和 DMS
15、O 对照组。各组均设 3 个复孔，每天每个浓度计数3 孔细胞，共计数 6d，求均值，绘制细胞生长曲线，并按公式TD=tlog2/(logNt-logN0)计算倍增时间 (TD)，t 代表培养时间，N0 代表起始计数获得的细胞数，Nt 代表培养 t 时间后计数获得的细胞数。1.2.2 克隆形成率的检测7取对数生长期 MDAMB435S 细胞接种 6 个培养瓶(1102/瓶)，常规培养 24h 后，随机选择其中 3 瓶更换为含0.1nmol/L Calphostin C 的培养基，3h 后再更换为不含Calphostin C 的培养基(实验组)，另外 3 瓶作为对照组。培养 21d后，用甲醇固定，
16、吉姆萨染色，计数克隆数(50 个细胞/克隆)，求均值，并计算克隆形成率(克隆形成率=平均克隆数/接种细胞数100%)。1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期取 6 瓶对数生长期 MDAMB435S 细胞，随机选择其中 3瓶更换为含 0.1nmol/L Calphostin C 的培养基(实验组)，另外 3 瓶作为对照组。3h 后收集细胞，固定、染色后应用流式细胞仪测定DNA 含量，计算机分析细胞周期并绘制细胞周期分布直方图。1.2.4 免疫细胞化学染色分析 PKC 蛋白分布的变化接种对数生长期 MDAMB435S 细胞于 6 张载玻片上，常规培养 24h 后，随机选择其中 3 张更换为含 0.1nmol/L Calphostin C 的培养基 (实验组)，另外 3 张作为对照组。3h 后取出载玻片进行免疫细胞化学染色。
