《脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱的建立及分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱的建立及分析（15页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱的建立及分析【摘要】 建立脾肾虚型重症肌无力患者血清蛋白质双向电泳图谱，观察脾肾虚型重症肌无力患者与正常人血清蛋白质差异表达情况。方法:采用反复冻融法抽提血清蛋白质，以优化的双向电泳技术分离血清蛋白质，建立脾肾虚型重症肌无力患者与正常人血清蛋白质双向电泳图谱，并采用二维电泳图谱专用软件对所得结果进行图谱分析。采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法对两组间比较所得目标蛋白质点进行质谱鉴定。结果:通过双向电泳，建立血清蛋白质双向电泳图谱，选取具有明显差异的蛋白点 21 个进行质谱鉴定，共鉴定出 8 种蛋白质
2、。结论:通过蛋白质组技术快速建立脾肾虚型重症肌无力患者血清蛋白表达图谱及质谱分析，可为进一步研究其发病机制及治疗手段提供实验基础。 【关键词】 重症肌无力; 蛋白质组; 电泳; 乙酰胆碱受体重症肌无力（myasthenia gravis， MG）主要是由乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor， AchR）抗体介导的，补体参与，细胞免疫依赖性，针对神经肌肉接头处突触后膜上乙酰胆碱受体的自身精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询免疫性疾病。对于 MG 的治疗至今仍缺乏有效手段。蛋白质组技术利用其核心技术双向电泳（two-dimen-sional gel elect
3、rophoresis， 2-DE）对组织或细胞总蛋白质进行分离1 ，并通过正常与疾病组织的差异表达蛋白比较，找到与该疾病相关的蛋白质分子。本研究通过建立脾肾虚型重症肌无力患者和正常人血清总蛋白质的双向电泳图谱，寻找有明显差异性表达的蛋白，对差异表达的蛋白进行鉴定和研究，为进一步研究 MG 发病机制以及 MG诊断治疗提供实验基础。1 材料与方法1.1 血清采集 MG 患者全血来自 20042005 年就诊于辽宁中医学院附属医院的门诊患者。根据典型临床表现、新斯的明试验、低频重复电刺激及单纤维肌电图等确诊，无其他自身免疫性疾病，未经其他免疫抑制治疗，并参照 1994 年版中医病证诊断疗效标准辨证为
4、脾肾虚型。正常人血清取自同时期健康志愿者。-70 冰箱冷冻保存备用。1.2 主要试剂 固相 pH 梯度干胶条 IPG strip（Amersham 公司产精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询品， 非线性 pH 310， 7 cm） 。3-3-（胆酰胺基丙基）二甲氨基丙磺酸盐3-（3-cholamidopropyl） dimethylamino-1-propanesul-fonate， CHAPS ，二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol， DTT） ，三丁基膦（tributyl phosphine， TBP） ，尿素，硫脲，碘乙酰胺（iodoacetamide， IAA
5、） ，丙烯酰胺（acrylamide） 、甲双丙烯酰胺（N， N-methylenebi-sacrylamide） ，四甲基乙二胺（N， N， N， N-tetram-ethyl-ethylenediamine， TEMED） ，过硫酰胺（am-monium persulfate， APS） ，三羟甲基氨基甲烷tris （hydroxymethyl） aminomethane 、甘氨酸（glycine， Gly）和十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate， SDS）均为 Bio-Rad公司产品。琼脂糖为华美生物公司产品。其他试剂均使用国产分析纯试剂。所有溶液均用 Milli
6、Q 水配制。1.3 主要仪器 高速冷冻离心机，德国 Eppendorf 公司产品;EttanTMIPGphor，Amersham Biosci-ences 公司产品;P-2000 分光光度仪，Hitachi 公司产品;SE-600 电泳仪，Amersham 公司产品;纯水装置，Millipore 公司产品;GS-710 光密度扫描仪，Bio-Rad 公司产品;冷却水循环系统，Cole-Parmer 公司产品;Bruker-Daltonics AutoFlex TOF-TOF LIFTMass Spectrometer，美国 Bruker-Daltonics 公司产品;LCQ Deca XP P
7、lus，美国 Thermo Finnigan 公司产品。精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询1.4 双向电泳1.4.1 血清总蛋白质的提取及定量 血清-70 反复冻融 4 次后，用 Agilent Multiple Affinity Re-moval Column 处理去除高丰度蛋白。使用 Agilent 5K 超滤管进行浓缩除盐，冻干回收的样品，-70 保存。用裂解液（9 mol/L 尿素、4% CHAPS、 65 mmol/L DTT和 cocktail 酶抑制剂）进行复溶，并采用考马斯亮蓝法进行蛋白质定量。1.4.2 等电聚焦 自-20 取出的胶条，室温下平衡 10 mi
8、n，以500 g 上样量在每份样本中加入上样缓冲液（8 mol/L 尿素、2% CHAPS、1% Bio-lyte 和 1% TBP）以及标准蛋白质分子，上样于泡胀槽中，加入矿物油覆盖。程序设置如下:30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 6 h。恒温 20 。等电聚焦电泳后 IPG 胶条在平衡液 1（Tris-base 50 mol/L 、尿素 6 mol/L、甘油 30%、SDS 2%、溴酚蓝 0.002%和 DTT 100 mg）中于振荡器上振荡 15 min; 然后置入平衡液 2（成分同平衡液 1，用 400 mg 碘乙酰胺代替 100 mg D
9、TT）同样于振荡器上振荡 15 min。精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询1.4.3 SDS-PAGE 垂直电泳 采用 12.5%的均匀 SDS2 聚丙烯酰胺凝胶（水 23.2 ml，30%丙烯酰胺溶液 32.46 ml，1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液 pH 8.8 20 ml，10% SDS 0.8 ml， 10% APS 0.4 ml，TEMED 3.76 l，胶总体积 80 ml） 。将平衡后的 IPG 胶条移至凝胶的上方，胶条一端放入低分子量蛋白质标准，0.5%的琼脂糖封胶。上下槽加入电极缓冲液（Tris 5 mmol/L，Gly 192 mmol/L 和
10、 SDS 0.1%） 。初始电流为每块胶 40 mA，电泳 20 min，然后以每块胶 60 mA 电流，直至溴酚蓝前沿。1.4.4 银染色 电泳结束后，采用硝酸银染色法，通过固定，硝酸银染色，显影，停显及脱色，至背景清晰。1.5 图像分析 每个样品常规进行 3 次二维电泳，用 GS-710 光密度扫描仪对电泳后的胶图分别进行扫描，所得扫描图像输入计算机，采用 Image-master 软件对图像进行背景消减、蛋白质点检测和校正，获取蛋白质点的位置坐标和表达量等分析。选取 Ratio 1.5 的蛋白质点认为有差异。所有数据的统计分析均采用 SPSS 12.0 软件，统计学分析采用 t 检验。精
11、品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询1.6 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析 用手术刀片切下胶上目标条带，进行切胶、胶上胰蛋白酶酶解 20 h ，抽提酶解肽段，Zip Tip 脱盐后点样，行基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF-MS）分析（飞行管长 2.7 m，加速电压 20 kV ，反射电压 23 kV） 。将第 1 级质谱得到的肽片段质量指纹图谱、肽质量指纹图谱与第 2 级质谱得到的肽序列信息一起用
12、来检索蛋白质数据库，找出匹配的蛋白质。1.7 数据库检索 将质谱鉴定所得的肽质量指纹谱（peptide mass fingerprinting， PMF）数据于 Bio-Works（Thermo Finnigan， San Jose， CA）软件搜索相应的库。搜索使用的数据库为 IPI human 蛋白库（SEQUEST 结果过滤参数为:当Charge+1，Xcorr1.9;当 Charge+2，Xcorr2.2;当Charge+3，Xcorr3.75;其中 DelCN0.1）以及 NCBI 上 Homo sapiens 的非冗余蛋白库（redundant data-base） 。检索参数为胰
13、蛋白酶解;氨基酸固定修饰方式为脲甲基半胱氨酸;模式为单同位素峰;肽片断最大误差控制在 100 ppm;肽片断最大分子量误差为0.5 Da;每个肽允许有 1 个不完全裂解位点。精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询2 结果2.1 脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱 的建立及分析 经 2-DE 技术及银染色后，得到了两组血清的双向凝胶电泳图，并于相同的条件下重复实验 3 次。在正常对照组细胞蛋白质组双向电泳图谱上可观察到 1 463179 个蛋白点，而脾肾虚型重症肌无力组可见到 1 50889 个蛋白点。见图 13 。上一页 1 2 下一页2.2 差异蛋白质点的鉴定和功能分析 通
14、过对 2-DE 凝胶上差异表达的 21 个蛋白质斑点进行切割，用胰蛋白酶消化后进行 MALDI-TOF-MS 检测。 21 个 点中获得了 13 张 PMF（图 4） ，另有 8 个蛋白质点未获得 PMF。将查询到的结果再结合 2-DE 图谱上相应蛋白质的分子质量和 PI 值等进行综合分析，在获得的 13 张 PMF 数据中有5 个无可信搜索结果。在数据库中匹配到符合结果要求的已知蛋白质有 8 个 。本次检测的 8 个质点在脾肾虚型重症肌无力患者血清图谱中表达均增加，且差异都具有统计学意义。鉴定的 8 个质点分别为:载脂蛋白 A-I（1382 号及 1438 号质点） 、白蛋白、胎球蛋白 B的
15、前体、载脂蛋白 E 的前体、转甲状腺蛋白前体、泰素耐药相关基精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询因-3 和前血清淀粉样蛋白 P 成分。这些蛋白分布广泛，并具有重要生物学功能。见表 1 和 2。图 1 正常人血清双向电泳图谱（略）Figure 1 Two-dimensional electrophoresis map of normal persons serum图 2 脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱（略）Figure 2 Two-dimensional electrophoresis map of MG patients serum图 3 正常人和脾肾虚型重症肌无力患者
16、血清蛋白差异性比较局部放大图（略）Figure 3 Augmented figure of differentially expressed 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询proteins （comparison between MG group and normal group）图 4 772 号样品肽指纹图谱（略）Figure 4 Peptide mass fingerprinting of Sample 772表 1 通过 MALDI-TOF-MS 质谱 IPI human 蛋白库搜索情况列表（略）Table 1 Differentially expressed proteins between MG patients and normal persons identified by2-DE and MALDI-TOF-MS or ESI-MS analysis of IPI human表 2 通过 MALDI
